[發明專利]一種人血管性血友病因子（vWF）活性的定量檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201810293453.6
• 申請日: 2018-03-30
• 公開（公告）號: CN108508197A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 李策生;王倩;周志軍;胡勇;岳勝蘭;汪菲菲;彭焱;林連珍;李陶敬;李娟;鄧志軍;陳克金;詹騫;譚敏
• 申請（專利權）人: 武漢生物制品研究所有限責任公司;國藥集團武漢血液制品有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/544
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 唐寧

1.一種人血管性血友病因子(vWF)活性的定量檢測試劑盒，所述試劑盒的定量范圍是3.2mIU/ml～51.5mIU/ml，所述的試劑盒包括，

(1)人Ⅲ型膠原包被的微量滴定板，

和(2)HRP酶標記的人抗vWF檢測抗體指示液：

所述的人Ⅲ型膠原包被的微量滴定板的制備方法是：以微量滴定板做載體，用包被緩沖液稀釋人Ⅲ型膠原至20μg/ml，按照100μl/孔的量包被微量滴定板，2～8℃包被過夜；

所述的HRP酶標記的人抗vWF檢測抗體指示液的制備方法是：用檢測抗體稀釋液將人抗vWF檢測抗體稀釋至0.5μg/ml。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，

所述的包被緩沖液的配置方法為：稱取0.795g Na₂CO₃,1.465gNaHCO₃溶于400ml注射用水中，用NaHCO₃調節pH至9.6±0.3，定容至500ml，用0.2μm濾器過濾，保存于2～8℃；優選的，調節所述的包被緩沖液的pH至9.5；

所述的檢測抗體稀釋液配制方法為：稱取11.90gHEPES,2.92g NaCl溶于400ml注射用水中，添加0.5ml Tween-20混勻，用6％NaOH調節pH至7.2±0.2，加牛血清白蛋白5.0g，定容至500ml，保存于2～8℃。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒還包括：封閉液、樣品稀釋液、洗液、顯色液、終止液；

所述的封閉液的配制方法為：稱取4.0g NaCl,0.58g Na₂HPO₄,0.1g KH₂PO₄,0.1g KCl，溶于400ml注射用水中，用5mol/L NaOH調節pH至7.4±0.2，加牛血清白蛋白5.0g，定容500ml；除菌過濾后保存于2～8℃；

所述的樣品稀釋液的配制方法為：稱取11.90g HEPES，2.92g NaCl溶于400ml注射用水中，添加0.5ml Tween-20混勻，用5mol/L NaOH調節pH至7.2±0.2，加牛血清白蛋白5.0g，定容至500ml；除菌過濾后保存于2～8℃；

所述的洗液的配制方法為：稱取8.0g NaCl,1.15g Na₂HPO₄，200mg KH₂PO₄,200mg KCl和1.0ml Tween-20溶于900ml注射用水中，調節pH至7.4±0.2，除菌過濾后保存于2～8℃。

所述的終止液為：2mol/L的H₂SO₄。

4.根據權利要求1-3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測抗體是多克隆抗體，優選為Anti-VWF/Von Willebrand Factor Antibody(HRP)，lifespan biosciences Inc.。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒的定量擬合方程為四參數Logistic擬合方程，優選的，所述的擬合方程為：Y＝(-0.707-5.28)/[1+(X/39.7)^0.58]+5.28

式中Y為檢測450nm處的吸光度，X為vWF因子的活性(單位為mIU/ml)。

6.根據權利要求1-3任一所述的試劑盒，其特征在于，所述的檢測試劑盒適用的樣本的環境因素包括：

(1)氯化鈉濃度：＜0.35mol/L、

(2)氯化鈣濃度：≤125mmol/L、

(3)vWF/FⅧ活性比值＞0.1。

7.使用權利要求1-6任一所述的試劑盒檢測vWF活性的方法，包括如下步驟：

(1)包被：用包被緩沖液(pH 9.5)稀釋人Ⅲ型膠原至20μg/ml濃度后，按照100μl/孔包被微量滴定板，2～8℃包被過夜；

(2)封閉：洗板3次后，加入封閉液200μl/孔37℃水浴1小時，再洗板3次拍干備用；

(3)上樣：取一支國際標準品用樣品稀釋液稀釋至51.5-3.218mIU范圍內，樣品稀釋液作為陰性對照，待檢樣品稀釋至標準曲線范圍內，按照100μl/孔加入微量滴定板，在37℃水浴1小時；

(4)檢測抗體：洗板3次后加入檢測抗體100μl/孔，在37℃水浴1小時；

(5)顯色：洗板3次后拍干，加入TMB底物100μl/孔37℃水浴顯色10分鐘；

(6)終止反應：加入終止液50μl/孔終止反應；

(7)讀數：終止反應后應在15分鐘內在450nm處讀取A_450nm值，并記錄。