[發明專利]一株光合細菌沼澤紅假單胞菌熒光GFP標記載體的構建及其電轉化方法

在審

• 申請號: 201810292042.5
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108949792A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 蘇品;翟忠英;陳麗潔;劉勇;張德詠;程菊娥;王忠勇;唐雯;孔小婷
• 申請（專利權）人: 湖南省植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/65
• 分類號: C12N15/65;C12N15/66;C12N15/78;C12N1/21
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種重組載體，其特征在于：所述重組載體包括光合細菌沼澤紅假單胞菌熒光GFP標記載體包括PBBR1MCS-2穿梭載體和綠色熒光蛋白標記基因GFP全長片段(PpckA+GFP+TpckA)，所述綠色熒光蛋白標記基因GFP全長片段包含光合細菌啟動子和終止子，所述綠色熒光蛋白基因GFP全長位于所述PBBR1MCS-2穿梭載體的ECORⅠ和SACⅠ兩限制性內切酶位點之間。

2.根據權利要求1所述的一種重組載體的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1，抽提光合細菌沼澤紅假單胞菌的基因組DNA；

S2，根據所述步驟S1的基因組DNA設計基因PpckA和TpckA的擴增引物；

S3，根據載體pRK415載體序列設計基因GFP的擴增引物；

S4，以所述S1的基因組為模板，以步驟S2的擴增引物進行多重PCR擴增得到擴增產物PpckA和TpckA片段；

S5，將所述步驟S4中擴增產物TpckA連接到T載體上，得到重組載體；

S6，以載體PRK415為模板，以步驟S3的擴增引物進行PCR擴增得到擴增產物；

S7，酶切S4所述擴增產物PpckA和S5重組載體，得到酶切后的擴增產物和重組載體；

S8，連接酶切后的擴增產物和重組載體，得到重組基因片段載體；

S9，酶切S8重組片段基因載體的擴增產物和原始載體，得到重組基因片段和酶切后的原始載體；

S10，連接重組基因片段和原始載體得到前重組載體；

S11，單酶切S6擴增產物和S10前重組載體；

S12，將所述酶切后的擴增產物連接到所述酶切后的前重組載體上得到重組載體。

3.根據權利要求2所述的一種重組載體的構建方法，其特征在于：S4中，所述PCR擴增條件為：94℃預變性5min,94℃變性45s,54℃復性30s,72℃延伸30s,30個循環，最后延伸10min。

4.根據權利要求2所述的一種重組載體的構建方法，其特征在于：S6中，所述PCR擴增條件為：94℃預變性5min,94℃變性45s,55℃復性30s,72℃延伸45s,35個循環，最后延伸7min。

5.根據權利要求2所述的一種重組載體的構建方法，其特征在于：S7中，采用限制性內切酶KpnⅠ和BglⅡ雙酶切所述片段和載體，S8中，將酶切后擴增產物用T4 DNA連接酶將兩個擴增片段連接在一起并連接到T載體上，S9中，采用限制性內切酶KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切所述擴增片段和原始載體，S10中，用T4 DNA連接酶將所述酶切后的擴增產物連接到原始載體上得到前重組載體，S11中，采用限制性內切酶BglⅡ單酶切所述擴增產物和前重組載體，S12中，將所述酶切后擴增片段用T4 DNA連接酶連接到所述酶切后的前重組載體上得到重組載體(工程菌)。

6.根據權利要求1-5所述的一株光合細菌沼澤紅假單胞菌熒光GFP標記的工程菌，其特征在于：所述熒光GFP標記的光合細菌沼澤紅假單胞菌含有權利要求1或2所述的重組載體。

7.根據權利要求6所述的一株光合細菌沼澤紅假單胞菌熒光GFP標記的工程菌，其特征在于：所述工程菌在大腸桿菌培養基中培養至OD660為0.6-0.8，通過噴施，注射和灌根方法將所述工程菌施用于植物葉面，莖部和根部，觀測工程菌在植物中定殖行為。

8.根據權利要求7所述的一株光合細菌沼澤紅假單胞菌熒光GFP標記的工程菌，其特征在于：所述大腸桿菌培養基為LB培養基，所述培養基為光合細菌專用培養基。

9.一種權利要求6所述的熒光GFP標記的光合細菌沼澤紅假單胞菌的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

S1，制備光合細菌沼澤紅假單胞菌感受態細胞；

S1，將重組載體電擊轉化至光合細菌沼澤紅假單胞菌感受態細胞中得到熒光GFP標記的光合細菌沼澤紅假單胞菌工程菌。