[發明專利]基于原核Argonaute蛋白的核酸檢測方法及其應用

有效

• 申請號: 201810291873.0
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108796036B
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 馮雁;荀冠華;劉倩
• 申請（專利權）人: 交弘生物科技（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44;G01N21/64
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;徐迅

1.一種用于檢測靶標核酸分子的檢測體系，其特征在于，該體系包含：

(a) 向導ssDNA對，所述的向導ssDNA對包括有義鏈向導ssDNA和反義鏈向導ssDNA，所述的向導ssDNA的長度為14-60nt，并且所述的向導ssDNA為5’-磷酸化的單鏈DNA分子；

(b) 基因編輯酶Pyrococcus furiosus Argonaute；和

(c) 熒光報告核酸，所述熒光報告核酸帶有熒光基團和淬滅基團；

其中，所述的靶標核酸分子為靶標DNA；

所述的靶標核酸分子被所述Pyrococcus furiosus Argonaute酶切割后，產生次級向導ssDNA；所述的次級向導ssDNA與所述的熒光報告核酸的序列是互補的；所述的次級向導ssDNA與所述的熒光報告核酸的序列互補結合后，引導所述Pyrococcus furiosus Argonaute酶對所述熒光報告核酸進行切割，從而產生可檢測的信號。

2.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，所述的向導ssDNAs的長度為16-40nt。

3.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，所述靶標核酸分子的不同分型對應的突變位點在向導ssDNA的第10、11位。

4.如權利要求1所述的檢測體系，其特征在于，所述的靶標DNA選自下組：單鏈DNA、雙鏈DNA、或其組合。

5.一種用于檢測靶標核酸分子的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：

(i) 權利要求1所述的檢測體系；和

(ii) 使用說明書，所述說明書描述了用所述的檢測體系檢測靶標核酸分子的方法。

6.一種非診斷性和非治療性的檢測樣本中是否存在靶標核酸分子的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a) 提供權利要求1所述的用于檢測靶標核酸分子的檢測體系；

(b) 將所述檢測體系與待檢測的樣本在一定溫度下進行反應，從而形成第一反應溶液；和

(c) 對所述第一反應溶液進行熒光檢測，從而獲得熒光信號值；

其中，所述第一反應溶液中檢測到熒光信號值，則表示所述樣本中存在靶標核酸分子；而所述第一反應溶液中沒有檢測到熒光信號值，則表示所述樣本中不存在靶標核酸分子；

所述溫度為87-99℃。

7.一種核酸酶Pyrococcus furiosus Argonaute的用途，其特征在于，用于制備基于二次切割檢測靶標核酸分子的試劑；

所述二次切割指在向導 ssDNA存在下，Pyrococcus furiosus Argonaute對靶標核酸分子進行剪切，形成次級向導 ssDNA，次級向導 ssDNA在Pyrococcus furiosus Argonaute的作用下，引導Pyrococcus furiosus Argonaute對與次級向導 ssDNA互補的熒光報告核酸進行剪切。

8.一種核酸酶Pyrococcus furiosus Argonaute的用途，其特征在于，用于制備基于二次切割檢測靶標核酸分子的試劑盒；

所述二次切割指在向導 ssDNA存在下，Pyrococcus furiosus Argonaute對靶標核酸分子進行剪切，形成次級向導 ssDNA，次級向導 ssDNA在Pyrococcus furiosus Argonaute的作用下，引導Pyrococcus furiosus Argonaute對與次級向導 ssDNA互補的熒光報告核酸進行剪切。