[發明專利]一種用于原位無損檢測胞外囊泡內核酸分子的探針及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201810291290.8
• 申請日: 2018-03-30
• 公開（公告）號: CN108642162A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 羅陽;劉煉華;賈玫;陳曉輝;張洪;邱曉沛;卿光超;劉春姣;王睿璇;周旋
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

本發明涉及一種用于原位無損檢測胞外囊泡內核酸分子的多面體探針及其制備方法和應用，包括核酸多面體骨架以及位于多面體頂角的識別靶基因的探針結構，所述探針結構上修飾淬滅基團，所述核酸多面體骨架上修飾發光基團；該探針可快速、靈敏、特異檢測胞外囊泡內多種核酸分子，可根據臨床或研究檢測需要對特定的靶標核酸分子進行設計應用。

技術領域

本發明屬于醫療檢測領域，涉及一種用于原位無損檢測胞外囊泡核酸小分子的多面體探針，可快速、靈敏、特異檢測已知序列的多種胞外囊泡核酸小分子；本發明還涉及多面體探針的制備方法和應用。

背景技術

胞外囊泡(EVs)是由腫瘤細胞等多種細胞分泌的、大小為50～1000nm的膜性囊泡小體，常存在于血液、尿液、腦脊液等大多數體液中。EVs可以攜帶多種胞內物質，如不同來源EVs可包含超過9700種蛋白質、3400種mRNA和2800種microRNA，在細胞間信號傳遞、腫瘤的發生與預后監測、免疫系統干預等生理病理活動中扮演了十分重要的角色。現有研究表明，受胞體體積的限制，特定來源的外泌體內miRNA濃度遠高于其母體細胞內濃度，濃度富集效率甚至可高達166倍，導致少量miRNA可在外泌體內被檢出而在循環系統中未能檢出。同時，與循環系統中的游離miRNA相比，外泌體內的miRNA由于受囊泡脂質雙層膜的保護因而具有更高的酶耐受性，可以在體液中長時間穩定存在，便于到達靶細胞進行穩定的信號轉導從而發揮生物學效能。與循環miRNA相比，外泌體內miRNA水平變化更能反映機體內生理病理狀態，因此可以作為一種新型的生物標志物，用以評進行疾病的早期診斷、治療監控和預后評估。

EVs的納米級結構和miRNA極短的核苷酸序列長度(～22nt)使得EVs內miRNA多重檢測極為困難。常規檢測組織細胞中miRNA的方法以RT-qPCR為金標準，其靈敏度高，但其cDNA合成、qPCR等步驟耗時耗力且相對昂貴，不適合大規模EVs內miRNA篩查；盡管NorthernBlotting和微陣列檢測技術各有其優點，但其靈敏度均欠佳且無法原位檢測。原位雜交(FISH)盡管可以實現細胞內miRNA在體檢測，然而其較低的靈敏度亦限制了其對于低濃度靶分子的檢出。電化學傳感器技術結合鎖核酸(LNA)技術可有效提升檢測特異性，然而其靈敏度和重復性仍有待提高，且上述技術均無法實現EVs的在體直接檢測。目前大量的檢測方法都集中在miRNA提取后進行檢測，而不同提取方法的miRNA提取效率差異極大，即便用數字PCR也無法反映出EVs內miRNA的真實豐度。

若能夠實現EVs原位在體檢測將能極大克服上述不一致問題，從而真實反映EVs內各種靶分子的豐度。為此，人們進行了如下探索：

Rhee et al曾嘗試著利用溶血素O蛋白(Streptolysin O)對EVs胞膜打孔，導入分子信標探針(Molecular Beacon，MB)并進行EVs在體檢測，研究發現溶血素O蛋白處理后的探針穿透效率較無處理樣本提高了175％。但在胞膜上打孔的方法會潛在破壞EVs外膜，存在EVs內容物外漏的風險，從而導致最終的檢測結果偏低。上述方法均缺乏對胞外囊泡完整性的保護，存在EVs內容物外漏的風險，從而可能導致最終的檢測結果偏低，仍不能準確檢測EVs miRNA。

因此，亟需一種不破壞胞外囊泡完整性的檢測方法，能夠準確檢測EVs內如miRNA等小分子。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種用于原位無損檢測胞外囊泡內核酸分子的多面體探針；本發明的目的之二在于提供用于檢測胞外囊泡miRNA的多面體探針的制備方法；本發明的目的之三在于提供所述多面體探針在制備檢測胞外囊泡內核酸分子的試劑中的應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

1、一種用于原位無損檢測胞外囊泡核酸分子的多面體探針，包括核酸多面體骨架以及位于多面體頂角的識別靶基因的探針結構，所述探針結構上修飾淬滅基團，所述核酸多面體骨架上修飾發光基團。