[發明專利]高表達IL10的臨床級間充質干細胞的制備方法及其用途

在審

• 申請號: 201810289165.3
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108588026A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 王斌;高天蕓;王留娣;黃菲菲;謝園園;劉威
• 申請（專利權）人: 南京鼓樓醫院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;A61K35/28;A61P19/08;A61P25/00
• 代理公司: 南京鐘山專利代理有限公司 32252
• 代理人: 戴朝榮

本發明提供一種高表達IL10的臨床級間充質干細胞的制備方法及其用途，所述方法包括如下步驟：1)從人臍帶中原代分離、擴增臍帶間充質干細胞，傳代培養；2)構建表達IL10的重組載體、線性化后待用；3)選擇步驟1)中第2～3代處于對數生長期的臍帶間充質干細胞用步驟2)IL10的重組載體進行電轉化；4)將步驟3)所得間充質干細胞培養、藥物篩選、傳代后即得高表達IL10的臨床級間充質干細胞。本發明的方法通過表達人IL10的重組載體修飾間充質干細胞，克服原始間充質干細胞存活時間短、聚集濃度低的特點，實現有效治療中樞神經系統損傷，為相關研究提供新的選擇途徑。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及干細胞治療技術領域，涉及一種高表達IL10的臨床級間充質干細胞的制備方法及其用途，尤其是涉及一種用于干細胞治療的高表達IL10的臨床級間充質干細胞的制備方法及其用途。

背景技術

中樞神經系統包含大腦和脊髓，是所有感官知覺和運動輸出的中心。中樞神經系統的修復和再生能力非常有限，因為受損/軸突切割的神經元和大多數橫切的中樞神經軸突不可再生。中樞神經系統損傷包括創傷性腦損傷和脊髓損傷，是臨床上創傷性致死和致殘的主要原因。

創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)和脊髓損傷(spinal cordinjury，SCI)是神經外科最常見的急危重癥之一，具有高發生率、高死亡率和高致殘率的特點，而且隨著社會的發展，其發生率呈逐年上升的趨勢。雖然近十年來其總體死亡率有所下降，但是仍有部分輕度患者會遺產生留永久的神經功能障礙，中重度患者的致殘率甚至高達66％～100％，為社會和家庭帶來了極大的負擔。其之所以具有非常高的死亡率和致殘率，一方面是由原發性創傷的嚴重程度決定的，另一方面是與創傷后的繼發性中樞神經損傷密切相關的，可以導致許多加重患者神經功能損傷的繼發性反應，其中最突出的是“神經炎癥反應”。

神經炎癥反應是中樞神經系統損傷后繼發性病理改變最突出的特點之一，其主要改變包括腦組織膠質細胞激活、外周循環炎癥細胞浸潤和炎癥細胞因子(如趨化因子、白細胞介素、腫瘤壞死因子)等介質的釋放。炎癥反應一旦被過度激活，就會嚴重損害腦實質，導致血腦屏障通透性改變、線粒體功能異常和細胞能量代謝障礙等，從而造成腦水腫、顱內壓升高和繼發性腦灌注不足等，最終造成神經細胞凋亡和創傷性軸索損傷(traumaticaxonal injury，TAI)等。

近年來，隨著對干細胞研究的不斷深入，越來越多的證據支持使用間充質干細胞緩解中樞神經系統損傷嚴重后果的作用，尤其是繼發性的炎癥反應。間充質干細胞(MSCs)作為一種實用的組織修復種子細胞，其取材方便、無明顯的免疫排斥反應、無附加損傷的危險及倫理道德等問題，尤其是臍帶來源的間充質干細胞，與骨髓相比具有更多的優勢，其增殖分化能力優于骨髓MSCs，而且免疫原性比骨髓MSCs低，可用于異體移植。除了將神經保護因子遞送至CNS之外，MSC還參與調節炎癥和內源性細胞的激活以參與組織修復。由于MSCs治療的可塑性，很好適應中樞神經系統損傷的復雜性能，這個特征使它們成為中樞神經系統損傷治療的有力候選。

中樞神經系統損傷的主要病理特征就是對神經元，神經膠質細胞，神經纖維和血腦屏障的造成物理損傷的原發性反應，和表現為多種病理生理機制的級聯，包括細胞毒性，基因活化，氧化損傷，水腫和炎癥的繼發性損傷，尤其是神經炎癥反應。成人體內缺乏促進損傷再生的微環境：與發育期相比，損傷后的腦組織內生長因子，營養因子和炎癥抑制因子相對匱乏。因此，僅靠內源性祖細胞/干細胞支持循環腦組織再生存在局限性。基于靶點的遺傳修飾的間充質干細胞為中樞神經系統損傷的治療帶來新的希望，原始的MSC植入宿主后有存活時間較短、損傷部位聚集濃度低等缺點，而修飾后的MSC能克服以上缺陷。通過合適的修飾，增強基因表達，使移植后的干細胞在損傷環境中富集并存活更久，并分泌功能性蛋白，增加MSC移植的器官特異靶向性和治療功效，改善臨床治療的效果。

遺傳修飾的細胞治療是一種增強治療效果的策略。已有研究顯示遺傳修飾的MSC對神經元細胞存活的治療潛力。目前尚無IL10基因修飾的人臍帶間充質干細胞治療中樞神經系統損傷的報道。