[發(fā)明專利]一種通過利用合成雙鏈DNA來誘導調(diào)節(jié)性T細胞的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810287362.1
• 申請日: 2018-03-30
• 公開（公告）號: CN108531479A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設計）人: 鄭頌國;勞利斯.奧利弗
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第三醫(yī)院（中山大學肝臟病醫(yī)院）
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N5/071;A61K31/713;A61K31/203;A61K31/436;A61K31/19;A61P29/00;A61P11/00;A61P1/00;A61P17/00;A61P37/02;A61P37/06;A61P37/08
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 宋靜娜;郝傳鑫

本發(fā)明公開了一種雙鏈DNA，其中一條鏈的堿基序列為：5’?ctcgaggg?3’，且第二個C堿基為甲基化的。同時，本發(fā)明還公開了所述雙鏈DNA在誘導調(diào)節(jié)性T細胞中的應用。本發(fā)明提供的雙鏈DNA在體外沒有免疫原性、不會損傷白細胞，可以誘導FoxP3陽性的調(diào)節(jié)性T細胞，可有效用于非感染性炎癥、感染后炎癥性疾病，呼吸道過敏性疾病、胃腸道過敏性疾病、皮膚過敏性疾病和自身免疫疾病等免疫相關疾病的治療。

技術領域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，具體涉及一種通過利用合成雙鏈DNA來誘導調(diào)節(jié)性T細胞的方法。

背景技術

調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory cell，Treg)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應性的T細胞亞群，可分為天然產(chǎn)生的自然調(diào)節(jié)性T細胞(nTreg)和誘導產(chǎn)生的適應性調(diào)節(jié)性T細胞(iTreg)，是機體維持自身耐受的重要組成部分，由胸腺或由外周活化的細胞發(fā)展而來。其中，轉錄因子Foxp3是Treg的特征性標記，F(xiàn)oxp3作為一個轉錄調(diào)控因子，通過直接調(diào)控多種基因來調(diào)節(jié)Treg的活性，在Treg細胞發(fā)育過程和功能起著關鍵的作用。

Treg與自身免疫疾病和器官移植的免疫排斥反應等有密切的關系，研究已經(jīng)證實了Treg可用于上述免疫相關疾病的治療，通過體外擴增Treg再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)可以改善疾病的進展。然而體內(nèi)存在的Treg數(shù)量很少，僅占正常人外周血CD4⁺T細胞中的5％～10％。因此，建立一種體外大量誘導產(chǎn)生Treg的方法，從而獲得足夠數(shù)量的Treg用于免疫相關疾病的治療，具有非常重大的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術的不足之處而提供一種雙鏈DNA，其在體外沒有免疫原性、不會損傷白細胞，可以誘導調(diào)節(jié)性T細胞，具有免疫抑制功能。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為：一種雙鏈DNA，其中一條鏈的堿基序列為：5’-ctcgaggg-3’，且第二個C堿基為甲基化的。

優(yōu)選地，所述雙鏈DNA可組成分子量為10～50000MW的生物性雙鏈DNA寡聚體，所述生物性雙鏈DNA寡聚體命名為Metvax。

所述雙鏈DNA在體外沒有免疫原性、不會損傷白細胞；且在體外可以抑制抗原、絲裂霉素和自身抗原誘導的T細胞增生，并且這個抑制作用成劑量依賴性。

本發(fā)明的另一目的，在于提供所述雙鏈DNA在誘導調(diào)節(jié)性T細胞中的應用。

本發(fā)明的又一目的，在于提供一種誘導調(diào)節(jié)性T細胞的方法。

本發(fā)明所述調(diào)節(jié)性T細胞是指具有CD4⁺FoxP³⁺免疫表型的調(diào)節(jié)性T細胞。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為，一種誘導調(diào)節(jié)性T細胞的方法，包括以下步驟：

(1)獲得人初始CD4⁺T細胞；

(2)將步驟(1)獲得的人初始CD4⁺T細胞與人抗CD3/CD28抗體、TGF-β、IL-2和所述的雙鏈DNA進行共培養(yǎng)；

(3)步驟(2)中培養(yǎng)體系培養(yǎng)3天后，更新含所述雙鏈DNA的培養(yǎng)液；

(4)步驟(3)中的培養(yǎng)體系繼續(xù)培養(yǎng)至少5天，即獲得誘導產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細胞。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中利用磁珠分選或流式細胞術分選的方法從人外周血中獲得人初始CD4⁺T細胞。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中雙鏈DNA在培養(yǎng)體系中的濃度為1-100ug/mL。

本申請發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在IL-2與TGF-β的存在下，可以加強雙鏈DNA對調(diào)節(jié)性T細胞的誘導作用。