[發明專利]提取外泌體及外泌體蛋白的方法

有效

• 申請號: 201810287204.6
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN110343664B
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 錢小紅;張養軍;高方園;焦豐龍;夏朝雙;呂雅瑤;吳瓊;余謙
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C07K1/14;G01N33/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;魏少偉

本發明公開了從人體體液或者細胞的培養液中提取外泌體及外泌體蛋白的方法。本發明提供的提取外泌體及外泌體蛋白的方法包括：向含有外泌體的待提取液中加入提取材料提取得到外泌體；提取材料為金屬氧化物或修飾有所述金屬氧化物的功能材料；金屬氧化物能與磷酸根離子發生雙配位作用；所述待提取液為來源于人體的體液、所述體液的稀釋液或細胞的培養產物。實驗證明，本發明的外泌體提取方法可以實現對人體體液或細胞的培養液中外泌體的高效提取，提取時間短，獲得的外泌體純度高，可以通過洗脫液洗脫獲得完整的外泌體，并且所用提取材料可回收重復利用；另外提取所得外泌體蛋白可發現，所得外泌體蛋白種類多且與外泌體功能更密切。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中，從人體體液或者細胞的培養液中提取外泌體及外泌體蛋白的方法。

背景技術

外泌體是哺乳動物細胞通過“內吞-外排”過程分泌到細胞外的一類囊泡狀結構，直徑約為30-150nm。外泌體不僅存在于細胞培養液中，也存在于血液、尿液、羊水、母乳、精液、唾液、胸腔積液等體液中，其組成包括脂質雙分子層以及細胞來源相關的蛋白質、RNA、DNA等物質。幾乎所有的細胞都可以產生外泌體，不同細胞來源的外泌體中既包含與細胞形成、結構和物質轉運相關的共有成分，也包含與來源細胞的生物功能相關的特異分子。外泌體作為一種細胞間交流、傳遞大量的生物功能分子的重要方式日益受到重視。研究表明，外泌體在一系列生理和病理過程中起到至關重要的作用。腫瘤相關外泌體能夠誘導癌癥發生、參與腫瘤靶向轉移、改善腫瘤生長的微環境、抑制免疫系統對腫瘤的免疫監督以及介導腫瘤細胞抗藥性，對腫瘤外泌體的分析和檢測有利于腫瘤的早期診斷、預后分析和療效評價。

目前常用的外泌體提取方法包括超速離心法、密度梯度離心法、聚合物沉淀法、超濾法、體積排阻色譜、免疫親和法。前四種方法基于外泌體獨特的密度、尺寸等物理學參數實現提取，缺乏特異性，不能滿足實際樣本中腫瘤細胞外泌體特異性提取和分析的要求。尤其人體體液樣本中，含有大量的低密度脂蛋白及乳糜微粒等微粒，這些微粒的粒徑和密度與外泌體接近，絕大部分方法無法將其與外泌體分離開，從而對外泌體的后續分析造成干擾。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是如何提取外泌體。

為解決上述技術問題，本發明首先提供了外泌體的提取方法，所述方法包括：向含有外泌體的待提取液中加入提取材料提取得到外泌體；所述提取材料為金屬氧化物或修飾有所述金屬氧化物的功能材料；

所述金屬氧化物能與磷酸根離子發生雙配位作用。

上述方法中，所述金屬氧化物可為TiO₂、ZrO₂、Al(OH)₃、Ga₂O₃、Fe₃O₄、Fe₂O₃、Nb₂O₃、SnO₂、HfO₂和/或Ta₂O₅；

所述修飾有所述金屬氧化物的功能材料具體可為修飾有所述金屬氧化物的氧化石墨烯、磁性納米顆粒或硅球。

所述材料的粒徑可為1～50μm。

上述方法中，所述待提取液可為來源于人體的體液、所述體液的稀釋液或細胞的培養產物。

所述體液的稀釋液可通過將所述體液利用緩沖液進行稀釋得到。所述緩沖液可為具有pH緩沖能力且能夠維持外泌體滲透壓的溶液。所述緩沖液具體可為DMEM緩沖液(Gibico公司，貨號31053-028)、HEPS(溶劑為水，溶質及其濃度分別為50mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸和150Mm NaCl，pH 8)或PBS(Corning公司，貨號：21-040-CVR)。將所述體液利用緩沖液進行稀釋時所述體液和所述緩沖液的體積比可為1:1～1:5。將所述體液利用緩沖液進行稀釋時所述體液和所述緩沖液的體積比進一步可為1:1。