[發明專利]人類黃韌帶干細胞的提取方法

在審

• 申請號: 201810283168.6
• 申請日: 2018-04-02
• 公開（公告）號: CN108504627A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 藍蔚仁;孫超;韓小博;李海音;蔣長青;潘賽;李長青
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學第二附屬醫院
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/074
• 代理公司: 重慶志合專利事務所(普通合伙) 50210
• 代理人: 胡榮琿

本發明涉及一種人類黃韌帶干細胞提取方法，該方法有以下步驟：1)取人類黃韌帶組織，沖洗，剪碎；2)剪碎的組織用一型膠原酶將黃韌帶消化；3)收集消化細胞，得到單細胞懸液；4)培養細胞，傳代三次；5)用濃度為10μg/ml的纖連蛋白溶液篩選干細胞。該方法成本低，提取的黃韌帶干細胞量大、存活率高、更易于在培養瓶內貼壁、細胞活性好。所得黃韌帶干細胞純度高，對人體無傷害，提取的黃韌帶干細胞還可以為椎間盤組織工程提供一種種子細胞。

技術領域

本發明涉及細胞工程技術領域，特別涉及到一種人類黃韌帶干細胞分離提取方法。

背景技術

干細胞療法是椎間盤組織工程研究的重點。穩定獲取一種足量、活性好、能夠多向分化的干細胞是干細胞療法的基礎。目前，用于椎間盤組織工程研究的干細胞類型主要是骨髓間充質干細胞。獲取骨髓間充質干細胞主要是購買細胞系或抽取人體骨髓提取。購買細胞系成本偏高，并且由于安全性以及倫理問題限制了購買細胞系將來的臨床研究及應用。抽取骨髓提取干細胞對人體有一定傷害，并且骨髓中細胞種類繁多，干細胞純度不能保證，提取干細胞的量也會因骨髓的量受到限制。

發明內容

本發明的目的是提供一種人類黃韌帶干細胞的提取方法，該方法成本低，提取的黃韌帶干細胞量大、存活率高、更易于在培養瓶內貼壁、細胞活性好。所得黃韌帶提取的干細胞純度高，對人體無傷害，提取的黃韌帶干細胞還可以為椎間盤組織工程提供一種種子細胞。

本發明的技術方案是：

人類黃韌帶干細胞提取方法，有以下步驟：

1)取人類黃韌帶組織，沖洗，剪碎；

2)剪碎的組織用一型膠原酶將黃韌帶消化；

3)收集消化細胞，得到單細胞懸液；

4)培養細胞，傳代三次；

5)用濃度為10μg/ml的纖連蛋白溶液篩選干細胞。

步驟1)所述沖洗，采用無菌PBS反復沖洗人類黃韌帶組織直至其無血液。

步驟2)所述消化在37℃孵箱恒溫消化12小時，取上清，用人間充質干細胞完全培養基終止消化。

步驟3)所述收集的方法是，步驟2)所述的組織消化的上清，離心，吸去上清，用人間充質干細胞完全培養基重懸細胞，形成單細胞懸液。

步驟4)所述的培養是將單細胞懸液在37℃二氧化碳濃度5％條件下，人間充質干細胞完全培養基培養，至細胞融合達70～80％后，傳代三次。

所述傳代的每次傳代的方法是：用PBS液清洗兩遍細胞，加入人間充質干細胞完全培養基終止消化，離心5分鐘，棄上清液，再加入人間充質干細胞完全培養基重懸細胞，將一份細胞分裝到3個三分容器中，進行下一次傳代。

步驟5)所述篩選采用濃度為10μg/ml的纖連蛋白(Sigma)溶液篩選。

所述篩選的方法是：用纖連蛋白PBS溶液覆蓋容器底部，4℃放置，12小時后吸去液體，用人間充質干細胞完全培養基清洗容器，吸去培養基，得到融合率已達80％的第三代細胞制得的單細胞懸液，將單細胞懸液放入纖連蛋白鋪被的容器中，37℃恒溫，30分鐘后吸去液體，再加入人間充質干細胞完全培養基，附著在鋪被有纖連蛋白的容器底部的細胞即為黃韌帶干細胞。

由于大多數腰椎間盤手術都需要不同程度的切除患者的黃韌帶組織，因此本發明取材來源廣泛，成本低，可以充分利用無害化處理的手術組織，同時還不會對患者造成如抽取骨髓等額外傷害。

由于黃韌帶組織與其他組織界限分明，因此黃韌帶組織易分辨和處理，所獲取的黃韌帶干細胞純度也更加高。