[發(fā)明專利]纖溶酶抑制劑rPI-T1的分離純化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810282901.2
• 申請日: 2018-04-02
• 公開（公告）號: CN110343170B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐梅;楊宇;陳宏超;康樂;李娜;石喬;蘭海英;石皎;李萍;王宏英;薛百忠
• 申請（專利權(quán)）人: 遠大生命科學(xué)（遼寧）有限公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C12P21/02;C07K1/18;C07K1/14;C12R1/84
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

1.一種纖溶酶抑制劑rPI-T1的分離純化方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）發(fā)酵分泌表達重組蛋白rPI-T1的畢赤酵母，將包含rPI-T1的畢赤酵母發(fā)酵液的上清液上樣至裝有Capto-MMC層析介質(zhì)并經(jīng)平衡緩沖液平衡的層析柱，先用平衡緩沖液平衡，并用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，再用洗脫緩沖液進行洗脫，收集得到洗脫液I；

其中，所述發(fā)酵使用無機鹽培養(yǎng)基，所述無機鹽培養(yǎng)基以甲醇作為碳源，并且包括以下以g/ml計的組分：1%磷酸、0.8%硫酸鉀、0.05%硫酸鈣、0.65%硫酸鎂、0.18%氫氧化鉀、1%酵母浸出粉；

所述步驟（1）的平衡緩沖液為50mM、pH4.0、電導(dǎo)為2.3-2.4ms/cm的醋酸鈉-醋酸緩沖液；所述洗脫緩沖液為100mM、pH8.0、電導(dǎo)為4.9~5.0ms/cm的Tris-HCl緩沖液；

（2）將步驟（1）獲得的洗脫液I上樣至裝有Qhp層析介質(zhì)并經(jīng)平衡緩沖液平衡的層析柱，先用平衡緩沖液平衡，再用洗脫緩沖液進行洗脫，收集得到包含rPI-T1的洗脫液II;

其中，所述步驟（2）的平衡緩沖液為100mM、pH8.0，電導(dǎo)為4.9~5.0ms/cm的Tris-HCl緩沖液；所述洗脫緩沖液為100mM的Tris-HCl和50mM的NaCl組成的pH8.0、電導(dǎo)為9.0-9.2ms/cm的緩沖液。

2.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，在步驟（1）中，所述包含rPI-T1的發(fā)酵液的上清液為分泌表達rPI-T1的畢赤酵母發(fā)酵液經(jīng)固液分離所獲得的上清液。

3.如權(quán)利要求2所述的分離純化方法，其特征在于，所述固液分離為碟片式離心機離心或板框式過濾。

4.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，所述包含rPI-T1的發(fā)酵液的上清液經(jīng)Capto-MMC層析柱洗脫之前經(jīng)過微濾。

5.如權(quán)利要求4所述的分離純化方法，其特征在于，所述微濾為經(jīng)過中空纖維柱的微濾。

6.如權(quán)利要求5所述的分離純化方法，其特征在于，所述中空纖維柱的孔徑為0.1μm。

7.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，在步驟（2）中，所述洗脫液II中rPI-T1的純度達97%以上。

8.如權(quán)利要求1所述的分離純化方法，其特征在于，步驟（1）中的發(fā)酵采用流加甲醇的方式。