[發(fā)明專利]犬臍帶間充質(zhì)干細胞及其制備方法和凍存方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810278145.6
• 申請日: 2018-03-31
• 公開（公告）號: CN108456657B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王小武;遲大明;朱春穎;郭春明;許曉椿
• 申請（專利權(quán)）人: 天津博雅秀巖生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02;A61K35/28;A61P19/02;A61P19/08;A61P21/00;A61P19/04;A61P25/00;A61P37/02;A61P27/02;A61P1/16;A61P9/00;A61P13/12;A61P3/10
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本發(fā)明涉及犬臍帶間充質(zhì)干細胞及其制備方法和凍存方法。具體的，所述方法包括以下步驟：消毒和清洗、消化處理、細胞培養(yǎng)、細胞傳代、細胞凍存。本發(fā)明從犬臍帶制備間充質(zhì)干細胞的方法呈現(xiàn)優(yōu)異的技術(shù)效果。所制得的間充質(zhì)干細胞能夠有益的治療犬科動物的關(guān)節(jié)炎、骨折、肌肉損傷、韌帶損傷、軟骨損傷、關(guān)節(jié)損傷、認知功能障礙、免疫介導性疾病、干眼癥、復發(fā)性葡萄膜炎、肝臟疾病、心臟病、腎臟疾病、糖尿病、胃腸道疾病、甲狀腺疾病、皮膚病。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于犬科動物疾病的干細胞治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及從犬的臍帶中制備間充質(zhì)干細胞的方法，以及這種間充質(zhì)干細胞在治療犬科動物疾病中的用途。本發(fā)明從犬臍帶制備間充質(zhì)干細胞的方法呈現(xiàn)優(yōu)異的技術(shù)效果。所制得的間充質(zhì)干細胞能夠有益的治療犬科動物的關(guān)節(jié)炎、骨折、肌肉損傷、韌帶損傷、軟骨損傷、關(guān)節(jié)損傷、認知功能障礙、免疫介導性疾病、干眼癥、復發(fā)性葡萄膜炎、肝臟疾病、心臟病、腎臟疾病、糖尿病、胃腸道疾病、甲狀腺疾病、皮膚病。進一步的，本發(fā)明還涉及對所述從犬的臍帶制備的間充質(zhì)干細胞進行凍存的方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs或MSC)是存在于機體間質(zhì)組織中的成體干細胞，可以從胎盤、臍帶、骨髓、脂肪組織等多種來源獲取。MSC具有很強的自我增殖能力和多向分化潛能。在可控條件下，它能在體內(nèi)或體外分化成如神經(jīng)細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞和成骨細胞等多種類型的細胞。同時MSC還具有免疫兼容性，不會造成免疫排斥反應，可進行同種異體移植。另外MSC還不具有致瘤性，但可支持造血，并能分泌多種有益細胞因子和免疫因子，因此可安全地用于組織再生和修復治療，在傳統(tǒng)醫(yī)療手段束手無策的疑難雜癥方面顯示出了巨大的治療潛能。在獸醫(yī)領(lǐng)域，干細胞療法能有效地提高動物的生活質(zhì)量，幫助它們擺脫病痛的困擾。其中犬不僅是重要的伴侶動物，也可經(jīng)訓練成為搜救犬、導盲犬等工作犬，另外它也是新藥評估以及臨床前藥物試驗的重要動物模型。目前，在犬干細胞治療方面，已經(jīng)有諸多通過間充質(zhì)干細胞注射成功治療犬關(guān)節(jié)炎，骨折、肌肉、韌帶或軟骨/關(guān)節(jié)損傷的案例。其它諸如犬類認知功能障礙、免疫介導性疾病、干眼癥、復發(fā)性葡萄膜炎、各類肝臟疾病、心臟病、腎臟疾病、糖尿病、胃腸道疾病、甲狀腺問題、皮膚病等方面的治療也正在評估中。

巨大的應用前景迫切需要建立高效的犬科動物間充質(zhì)干細胞分離制備方法，以規(guī)模化地分離出高質(zhì)量MSC。目前犬上常用的MSC來源為脂肪和骨髓，但從這兩種來源獲取干細胞的過程不可避免地會給供體動物帶來創(chuàng)傷和痛苦，而盡管胎盤/臍帶屬于動物生產(chǎn)時的廢棄物，但它們也是MSC豐富的來源之一，因此通過它們作為樣本分離細胞可以更好地保護動物。

目前從犬的器官/組織，特別是從犬的臍帶，分離制備間充質(zhì)干細胞的方法有限，且有其局限性。盡管從人類相關(guān)組織、器官中分離干細胞已有眾多方法報道，例如本申請人研發(fā)團隊的中國發(fā)明專利公開號CN102660501 A(中國專利申請?zhí)?01210159918.1)公開了一種分離和擴增臍帶新鮮組織間充質(zhì)干細胞的方法，然而，可能是由于物種差異的原因，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，上述專利文獻的方法并不適合直接用于犬科動物。

因此，本領(lǐng)域迫切期待有新的方法來從犬的臍帶分離制備間充質(zhì)干細胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種從犬的臍帶制備間充質(zhì)干細胞的方法，已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明方法從犬的臍帶制備間充質(zhì)干細胞，呈現(xiàn)令人鼓舞的效果，本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。

為此，本發(fā)明第一方面提供了從犬的臍帶制備間充質(zhì)干細胞的方法和/或凍存方法，該方法包括以下步驟：

(1)消毒和清洗：用消毒液(例如酒精，例如75％乙醇作為消毒液)對犬的臍帶組織(例如，新鮮離體組織)表面進行消毒，將臍帶剪開，平鋪(例如，平鋪于直徑為5-20cm的培養(yǎng)平皿內(nèi)，例如10cm的培養(yǎng)平皿)，通過緩沖液(例如PBS緩沖液，例如pH6.5的0.025M磷酸二氫鈉緩沖液)清洗臍帶組織，以減少臍帶組織上的紅細胞；(本步驟通常是在生物安全柜內(nèi)進行處理)