[發明專利]一種冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和應用

在審

• 申請號: 201810273099.0
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108384793A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 朱希強;張芳芳;張金華;劉飛;薛佳俊;袁超
• 申請（專利權）人: 山東大學;山東省藥學科學院
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/18;C12N15/81;C12N1/19;C12P7/42;C12R1/84
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和應用。本發明所述阿魏酸酯酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。該基因編碼的阿魏酸酯酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本發明所述阿魏酸酯酶基因可用于體外生成阿魏酸。經檢測，去淀粉麥麩混懸液中阿魏酸的釋放率為75.3％，遠高于其它阿魏酸酯酶基因，為阿魏酸生產提供了新的酶源。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和應用。

背景技術

阿魏酸(Ferulic Acid)的化學名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是肉桂酸的衍生物之一，普遍存在于植物細胞中，與多糖、蛋白質、木質素通過酯健結合成為細胞壁的骨架，使整個細胞壁變得堅硬。阿魏酸是公認的天然抗氧化劑，也是近年來國際認知的防癌物質，具有抑制血小板聚集，抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用，此外，阿魏酸具有強大的長波紫外線吸收功能。目前在食品，醫藥，化妝品工業中廣泛應用。

阿魏酸酯酶(Ferulic acid esterases，FAEs)又稱肉桂酸酯酶，它是一種羧酸酯酶，指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的酶。用阿魏酸酯酶處理植物性原料，一方面可以促進半纖維素、木質素與纖維素的分離，另一方面可以釋放出阿魏酸。阿魏酸酯酶在食品，造紙，飼料，生物合成等方面具有廣泛的應用價值。

目前已在多種微生物中發現了阿魏酸酯酶，包括細菌、真菌和酵母等。不同微生物所分泌產生的阿魏酸酯酶具有各自不同的特性，它們在編碼序列、氨基酸結構、物理化學性質和及催化特性上都有所不同。目前對于阿魏酸酯酶的研究，主要集中在對原始菌株培養條件的優化以增加酶活或產酶量，也有部分研究者通過基因工程技術來提高阿魏酸酯酶的酶活，但酶活仍普遍偏低。

因此，發現新的高效阿魏酸酯酶基因并實現高效表達，對阿魏酸的工業化生產具有重要意義。

發明內容

本發明主要目的是，提供一種阿魏酸酯酶基因及其工程菌和應用。

為實現上述目的，本發明采用以下技術方案。

本發明目的之一，提供一種阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

進一步，所述阿魏酸酯酶基因來源于冠突曲霉(Aspergillus cristatus)3.6088(購于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號為3.6088)，基因全長為849bp。

本發明目的之二，提供一種所述阿魏酸酯酶基因編碼的阿魏酸酯酶，所述阿魏酸酯酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本發明目的之三，提供一種含有上述的冠突曲霉阿魏酸酯酶基因的重組表達載體。

進一步，所述重組表達載體為將上述冠突曲霉阿魏酸酯酶基因插入到pGAPZα-A表達載體的多克隆位點得到重組質粒。

本發明目的之四，提供一種含有所述的冠突曲霉阿魏酸酯酶基因的表達盒、轉基因細胞系或重組菌。

進一步，所述重組菌是將所述的重組表達載體轉化畢赤酵母SMD1168H得到的重組菌。

進一步，所述重組菌的構建方法，具體如下：

(1)設計引物fae-F和fae-R，序列分別如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

以冠突曲霉3.6088cDNA為模板，擴增得到序列如SEQ ID No.1所示的阿魏酸酯酶基因；

(2)根據SEQ ID No.1所示序列設計引物fae-A-F和fae-A-R，序列分別如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示，以冠突曲霉3.6088cDNA為模板，擴增得到含所述阿魏酸酯酶的人工合成DNA序列；