[發明專利]一種寄生蟲檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201810272384.0
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108588252A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發明（設計）人: 周斌;王樹明
• 申請（專利權）人: 杭州泰熙生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭知橋律師事務所 33256
• 代理人: 王梨華;陳麗霞

本發明涉及寄生蟲檢測領域，公開一種寄生蟲檢測試劑盒及其檢測方法。一種寄生蟲檢測試劑盒，試劑盒的核酸反應體系內包括一種或多種核酸擴增引物對，用于擴增錐蟲、利什曼原蟲、巴西利什曼原蟲、chagasi利什曼原蟲、克氏錐蟲、朗杰爾氏錐蟲、利什曼原蟲、墨西哥利什曼原蟲或亞馬遜利什曼原蟲、panamensis杜氏利什曼原蟲、guyanensis利什曼原蟲、或peruviana利什曼原蟲的DNA的核苷酸序列，檢測方法為使用一種或多種核酸擴增引物對進行核酸擴增反應，并通過檢測核酸擴增引物對的特異性擴增子檢測寄生蟲的DNA的存在。與PCR相比，RPA的擴增方式來診斷是在恒溫簡單的設備進行的，低成本，靈敏度高，可用于錐蟲、利什曼原蟲在人類早期感染和感染的狗的鑒定，以減少在人體的VL發病率。

技術領域

本發明涉及寄生蟲檢測領域，尤其涉及一種寄生蟲檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

利什曼病，是影響超過88個國家在世界上顯著全球影響的疾病，引起利什曼病的原生動物為利什曼原蟲。皮膚利什曼病(CL)的特征是慢性皮膚潰瘍，可能影響個體的功能狀態，導致昂貴的和不及時治療，并導致毀容疤痕。總的來說，全球有10-20萬例利什曼病。利什曼病導致包括局部皮膚利什曼病疾病(LCL)，破壞性鼻腔和粘膜利什曼病(ML)的口咽病變的頻譜。LCL是最常見的Viannia亞屬種(L.(V.)braziliensis，L.(V.)panamensis，L.(V.)guyanensis，L.(V.)peruviana)，并引起由利什曼原蟲亞屬種程度較輕(L.(V.)墨西哥，L.(V.)亞馬遜)。ML通常由L.braziliensis和較不頻繁由L.(V.)panamensis或L.(V.)guyanensis引起的。

在利什曼病的診斷的主要挑戰是，這種疾病在資源有限的地區發生。目前寄生蟲學診斷必須在醫院設置，多數患者沒有診斷的條件。在軍事野外作業和訓練中，先進的實驗室設備和醫務人員稀缺。對于CL或ML，皮膚(皮膚)或粘膜組織或病變活檢打孔刮出是必要的，經病理組織學診斷的敏感性，涂片培養在顯微鏡下觀察成功率低(40-70％)。基于抗體的測試利什曼病的任何臨床形式是有用的，利用PCR實現，但成本高，其在資源貧乏的地區實施不夠現實。

因此需要其它方法檢測傳染病，方法需要快速，廉價，特異性和靈敏，并不需要昂貴的設備或容易出現故障的設備。

本發明人已經開發了基于其能夠在生物樣品中檢測錐蟲的的重組酶聚合酶擴增(RPA)方法下的一個敏感等溫擴增試驗。錐蟲是由僅具有單鞭毛區分一組動質體原生動物。錐蟲涉及脊椎動物、無脊椎動物或植物的生命周期。寡核苷酸引物被設計為擴增利什曼原蟲或錐蟲核酸，引物被引導到動基體的DNA(kDNA)。如本文中所使用的動基體是包含線粒體基因組的許多拷貝的大線粒體內的環狀DNA(稱為kDNA)的網絡。Kinetoplasts僅在類動基體目原生動物發現。一個動基體通常是相鄰的生物體的鞭毛基體，這表明它是緊密結合的細胞骨架。引物被設計成使得它們不其它利什曼原蟲屬或錐蟲的橫擴增核酸(例如，kDNA)。通過使用這些引物之一可以識別的受試者，例如人或狗，感染了特定寄生蟲(例如，嬰兒利什曼原蟲)和排除的檢測具有重疊宿主范圍相關原生動物寄生蟲的可能性。

重組酶聚合酶擴增(RPA)是一個單管等溫替代聚合酶鏈反應(PCR)。通過加入逆轉錄酶的RPA反應可以檢測RNA以及DNA，而不需要一個單獨的步驟，以產生cDNA的。因為它是等溫的，RPA反應需要比PCR簡單得多的設備。RPA反應在理論上可以快速簡單地通過保持管運行。這使得RPA為開發低成本，快速，定點護理分子測試的理想選擇。與常規的PCR需要昂貴的設備相比，RPA在恒定溫度、不復雜的設備進行的，可以用作低成本，且靈敏度高的診斷測試，以減少或改善公共衛生機構的電流的VL的控制程序的有效性的中斷利什曼原蟲(如，嬰兒利什曼原蟲)，以人類群體的傳輸，這是著眼于人類早期檢測和受感染的狗的鑒定。狗是嬰兒利什曼原蟲感染的人類的主要來源，受感染的動物，并從發送周期隨后除去的準確識別是最有效的策略之一，以減少在人體的VL發病率。