[發明專利]一種豬細小病毒的全長感染性DNA克隆及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201810271877.2
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108410885A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 崔尚金;張玲玲
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/35
• 分類號: C12N15/35;C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10;C12N7/00
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種豬細小病毒的全長感染性DNA克隆及其構建方法和應用。所述的豬細小病毒的全長感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通過該全長感染性DNA能夠拯救出與PPV野毒具有相似生長特性的拯救病毒，并且在全長感染性克隆中引入遺傳標記EcoRv，該標記在傳代之后依然能夠穩定存在，可以作為鑒定野毒與拯救病毒可靠的遺傳標志。此外，本發明還建立了的豬細小病毒反向遺傳學操作系統，可用于豬細小病毒蛋白的毒力分析，并據此可以制備新型滅活疫苗或弱毒疫苗。本發明的提出為研究豬細小病毒基因結構與功能及致病性研究等方面提供平臺，也為研究針對豬細小病毒病的疫苗等奠定了基礎。

技術領域

本發明涉及一種病毒感染性克隆及其構建方法，特別涉及一種豬細小病毒的全長感染性克隆及其構建方法，還涉及豬細小病反向遺傳學操作系統的建立。本發明屬于生物技術領域。

背景技術

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是細小病毒科細小病毒屬的成員，是引起母豬繁殖障礙的病原。1966年，Mayr進行豬瘟病毒組織培養時發現了PPV。Cartwright和Huck于1967年首次在英國豬流產胎兒的臟器中分離出豬細小病毒以來，現已在比利時(1967)、德國(1968)、美國(1972)、日本(1972)、荷蘭(1972)、澳大利亞(1973)、芬蘭(1979)、法國(1977)和加拿大(1978)等國都有相繼的報道。在我國，豬細小病毒發現較晚，但是流行情況卻相當普遍。臨床上，該病毒不僅可以導致初孕母豬的繁殖障礙，而且還能引起仔豬的皮膚炎癥和腸炎性腹瀉，給世界各國的養豬行業造成了巨大的經濟損失。

根據ICTV第九次分類報告，PPV屬于細小病毒科、細小病毒亞科、細小病毒屬。PPV與多數細小病毒一樣，對外界理化因素具有很強大的抵抗力，耐熱能力極強，據Cartwright等的試驗，當56℃30min加熱處理時，無論病毒的傳染性還是凝集紅細胞的能力，都無明顯改變；70℃2h感染力有所下降，但并不喪失；80℃5min即可失去活性。對脂、酶溶劑及有機溶劑抵抗力強，耐酸范圍大，感染能力在pH3.0～10.0范圍內沒有明顯的改變。具有血凝性，能凝集人、猴、豚鼠和雞的紅細胞，對豚鼠紅細胞凝集效果最好。

細小病毒都在細胞核內增殖。依賴病毒屬除外，其它細小病毒均能自我復制，但是需要依賴宿主細胞有絲分裂過程中的某些功能。所以體外培養該病毒時，必須在細胞傳代培養的同時或最遲24h內接種病毒，即同步接毒，才能達到病毒良好增殖的目的。PPV只能在來源于豬的細胞和人的某些傳代細胞中增殖培養，其中以豬的原代腎細胞較為常用。PPV在PK-15細胞系中培養，當接種時機適當時，于2～5天出現細胞病變，7～8天達到收獲程度。

PPV與其它細小病毒具有共同的形態結構特征，外觀呈六角形或圓形，無囊膜，直徑20～23nm，二十面體等軸立體對稱，衣殼約由32個殼粒組成，核心含有單股線狀DNA，分子量為1.4×10⁶，G+C＝48％，DNA約占整個病毒粒子的26.5％，病毒在氯化銫中的浮密度為1.37～1.39g/cm³。PPV基因組是單鏈線狀DNA分子，大小約5000nt。根據GenBank報道的序列，PPV全長基因組為5075nt(序列號：NC_001718)。