[發明專利]一種提高茄子病毒誘導基因沉默效率的方法

在審

• 申請號: 201810271753.4
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108624617A
• 公開（公告）日: 2018-10-09
• 發明（設計）人: 劉軍;周曉慧;楊艷;鮑生有;莊勇
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.一種提高茄子病毒誘導基因沉默效率的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)茄子病毒基因重組表達載體的構建；

(2)適宜侵染萌芽期種子制備：利用1‰赤霉素浸種12h后，28℃催芽直到種子露白后2～3d，芽長0.5～1cm時備用；

(3)侵染液的制備；

(4)侵染液接種：利用真空滲透方法侵染接種茄子萌芽期種子：真空侵染系統由真空干燥器和便攜式真空泵組成，抽真空滲透壓強為-25kpa，抽氣時間為2min；

(5)接種后培養：接種后先放入20℃人工氣候箱中暗培養至破土后再轉入正常培養，培養環境為25℃條件下光照16h，20℃條件下黑暗8h，相對濕度在50％～60％；

(6)誘導茄子病毒基因沉默的表型觀察與檢測。

2.根據權利要求1所述的一種提高茄子病毒誘導基因沉默效率的方法，其特征在于，所述步驟(1)茄子病毒基因重組表達載體的構建為，根據茄子PDS基因序列特征設計引物SmPDS-XbaI-F:SEQ ID NO.1和SmPDS-BamHI-R:SEQ ID NO.2，以茄子的cDNA為模板進行PCR擴增反應，獲得茄子PDS基因沉默片段，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，將獲得茄子PDS基因片段與TRV2質粒通過XbaI和BamHI酶切位點連接，獲得TRV2-SmPDS重組質粒。

3.根據權利要求2所述的一種提高茄子病毒誘導基因沉默效率的方法，其特征在于，所述侵染液的制備為，從添加了50mg/L慶大霉素、50mg/L卡納霉素和25mg/L利福平的YEB平板上挑取含有表達載體TRV2-SmPDS、TRV2對照載體、TRV1載體的陽性農桿菌GV3101單克隆分別在添加了50mg/L慶大霉素、50mg/L卡納霉素和25mg/L利福平的YEB液體培養基中進行培養，然后分別將菌液按照1:50比例加入到含10mmol/LMES、20μmol/L乙酰丁香酮、50mg/L慶大霉素、50mg/L卡納霉素和25mg/L利福平的YEB液體培養基中搖菌到OD600值在1.0-2.0，然后離心去上清收集各菌體，加入添加了10mmol/LMgCl₂、200mmol/L乙酰丁香酮、10mmol/LMES的MMA緩沖液懸浮菌體，調節懸浮液OD600值在1.0，將TRV1與TRV2-SmPDS、TRV2菌液等體積混合，室溫暗處放置3個小時準備接種。

4.根據權利要求1-3之一所述的一種提高茄子病毒誘導基因沉默效率的方法，其特征在于，步驟(4)誘導培養10d后基因沉默現象開始出現。

5.根據權利要求2或3所述的一種提高茄子病毒誘導基因沉默效率的方法，其特征在于，步驟(4)誘導培養10d后基因沉默現象開始出現，基因PDS沉默表現為接種植株出現白化現象。

6.根據權利要求5所述的一種提高茄子病毒誘導基因沉默效率的方法，其特征在于，用于qRT-PCR的SmPDS基因引物包括上游引物PDS-RT-F:SEQ ID NO.4，下游引物PDS-RT-R:SEQID NO.5，內參基因Actin引物包括上游引物SmAct-F：SEQ ID NO.6和下游引物SmAct-R:SEQID NO.7檢測誘導茄子病毒基因沉默的表達水平。