[發(fā)明專利]一種弓形蟲重組抗原的制備、弓形蟲檢測試劑盒及其制作方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810271531.2
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108614117A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周斌;王樹明
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州泰熙生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 浙江杭知橋律師事務(wù)所 33256
• 代理人: 王梨華;陳麗霞

1.一種弓形蟲重組抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，提取弓形蟲基因組DNA

弓形蟲RH株速殖子自液氮中取出復(fù)蘇后，腹腔接種小鼠，3d后，從小鼠腹水中收集弓形蟲速殖子，PBS洗滌后，重懸于0.2mL含1％SDS的STE溶液中，補(bǔ)加蛋白酶K至0.1mg/mL，37℃消化過夜；用飽和酚、飽和酚氯仿、氯仿各抽提一次，提取出DNA，無水乙醇沉淀DNA，之后溶于TE緩沖液中，-20℃冷存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二，GRA7基因的體外擴(kuò)增和克隆

使用如下引物，正向引物：5′-GGATCCATGGCCCGACACGCAAT-3′；反向引物：5′-GCGGCCGCCTGGCGGGCATCCTC-3′，以步驟一所得基因組DNA作為模板擴(kuò)增反應(yīng)；GRA7基因擴(kuò)增的DNA在1％瓊脂糖凝膠中被染色成可見的賽博綠，然后，GRA7基因擴(kuò)增的DNA被DNA純化試劑盒切割和回收；

步驟三，原核表達(dá)載體的構(gòu)建

步驟二中回收的DNA通過T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒克隆到pTZ57R載體中，連接反應(yīng)時(shí)，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物大腸桿菌L1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有100mg/mL氨芐西林的瓊脂平板上，在含有X-gal和IPTG的瓊脂平板上篩選重組抗原和非重組抗原，用BamH1酶和Not1酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性酶切分析，GRA7片段通過DNA純化試劑盒從1％瓊脂糖凝膠中提取出來；

步驟四，重組GRA7的表達(dá)與鑒定

設(shè)定溫度為37℃、攪拌速度為250rpm，含有pET28a-GRA7的大腸桿菌菌株Top10F在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中生長，蛋白質(zhì)生長過程中加入1mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間為3h；進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弓形蟲重組抗原的制備方法，其特征在于：STE溶液由10mmol/L Tris-HCl、1mg/mL EDTA、0.15mmol/LNaCl組成，STE溶液的pH值為8.0。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弓形蟲重組抗原的制備方法，其特征在于：PCR反應(yīng)使用50ul的反應(yīng)體系，反應(yīng)體系包括50ngDNA，濃度為10pmol的1.5ul正向引物，濃度為10pmol的1.5ul反向引物，50mM MgCl₂，200mM DNTP，10×PCR緩沖液，2.5ul聚合酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的弓形蟲重組抗原的制備方法，其特征在于：PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性40s；58℃退火60s；72℃延伸60s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

5.弓形蟲檢測試劑盒，其特征在于：包括PVC板、硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設(shè)有檢測線、對照線；檢測線上包被權(quán)利要求1～4所述弓形蟲重組抗原，在對照線處包被IgM抗體；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人u鏈抗體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的弓形蟲檢測試劑盒，其特征在于：辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人u鏈抗體放于含有5％牛奶的濃度為0.01M、pH為7.2的PBS緩沖液中，抗人u鏈抗體與PBS緩沖液的體積比為1:1500。