[發(fā)明專利]基于KRAS和NDRG4基因以及血紅蛋白確定結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的方法和系統(tǒng)

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810271406.1
• 申請(qǐng)日: 2018-03-29
• 公開（公告）號(hào): CN108486237B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 毛瑞芳;陳璟;王云霞;王君;秦楠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海銳翌生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/6886;G01N33/72
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 趙天月

1.檢測SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第12密碼子和第13密碼子突變的試劑、檢測SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第6和第10個(gè)CpG位置的基因甲基化連鎖水平的試劑和檢測血紅蛋白的試劑在制備確定結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的試劑中的用途，其特征在于，所述制備確定結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的試劑的使用方法包括：

分別獲得待測樣本的KRAS基因和NDRG4基因，并將所述NDRG4基因進(jìn)行甲基化處理；

分別對(duì)所述KRAS基因和經(jīng)甲基化處理的NDRG4基因進(jìn)行測序，獲得KRAS基因測序結(jié)果和NDRG4基因測序結(jié)果；

將所述KRAS基因測序結(jié)果中第一目標(biāo)靶點(diǎn)位置的基因序列與第一參考序列進(jìn)行第一比對(duì)，計(jì)算出KRAS基因突變率；

將所述NDRG4基因測序結(jié)果中第二目標(biāo)靶點(diǎn)位置的基因序列與第二參考序列進(jìn)行第二比對(duì)，計(jì)算出NDRG4基因甲基化連鎖比率；

對(duì)所述待測樣本進(jìn)行血紅蛋白檢測；

基于所述KRAS基因突變率、NDRG4基因甲基化連鎖比率以及血紅蛋白檢測結(jié)果，確定所述待測樣本是否存在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞；

基于下列標(biāo)準(zhǔn)，確定所述待測樣本是否存在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞：

當(dāng)所述血紅蛋白檢測結(jié)果為陽性時(shí)，

所述KRAS基因突變率低于0.004945且NDRG4基因甲基化連鎖比率低于0.001218，是所述待測樣本不存在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的指示；

所述KRAS基因突變率高于0.004945或NDRG4基因甲基化連鎖比率高于0.001218，是所述待測樣本存在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的指示；

當(dāng)所述血紅蛋白檢測結(jié)果為陰性時(shí)，

所述KRAS基因突變率高于0.002385且NDRG4基因甲基化連鎖比率高于0.001916，是所述待測樣本存在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的指示；

所述KRAS基因突變率低于0.002385或NDRG4基因甲基化連鎖比率高于0.001916，是所述待測樣本不存在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的指示；

所述第一參考序列如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

所述第二參考序列如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

所述第一目標(biāo)靶點(diǎn)選自如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的第12密碼子和第13密碼子；

所述第二目標(biāo)靶點(diǎn)選自如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的第6和第10個(gè)CpG位置。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述待測樣本來源于糞便。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，采用糞便潛血法檢測血紅蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞為腸道上皮腫瘤細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞為人源腸道上皮腫瘤細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述甲基化處理是采用亞硫酸氫鹽進(jìn)行的。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，分別獨(dú)立地將所述KRAS基因和經(jīng)甲基化處理的NDRG4基因進(jìn)行測序所得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、過濾、比對(duì)、拼接以及質(zhì)量值校正，以便獲得所述KRAS基因測序結(jié)果和NDRG4基因測序結(jié)果；

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述測序的測序深度不少于20000′。

9.一種實(shí)施權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述用途中限定的確定結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的試劑的系統(tǒng)，其特征在于，包括：

獲取基因裝置，適于分別獲得待測樣本的KRAS基因和NDRG4基因，并將所述NDRG4基因進(jìn)行甲基化處理；

測序裝置，所述測序裝置與所述獲取基因裝置相連，適于分別對(duì)所述KRAS基因和經(jīng)甲基化處理的NDRG4基因進(jìn)行測序，獲得KRAS基因測序結(jié)果和NDRG4基因測序結(jié)果；

比對(duì)裝置，所述比對(duì)裝置與所述測序裝置相連，適于將所述KRAS基因測序結(jié)果中第一目標(biāo)靶點(diǎn)位置的基因序列與第一參考序列進(jìn)行第一比對(duì)，計(jì)算出KRAS基因突變率；

將所述NDRG4基因測序結(jié)果中第二目標(biāo)靶點(diǎn)位置的基因序列與第二參考序列進(jìn)行第二比對(duì)，計(jì)算出NDRG4基因甲基化連鎖比率；

血紅蛋白檢測裝置，適于對(duì)所述待測樣本進(jìn)行血紅蛋白檢測；

判定裝置，所述判定裝置分別與所述比對(duì)裝置和血紅蛋白檢測裝置相連，適于基于所述KRAS基因突變率、NDRG4基因甲基化連鎖比率以及血紅蛋白檢測結(jié)果，確定所述待測樣本是否存在結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞；

所述第一參考序列如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

所述第二參考序列如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

所述第一目標(biāo)靶點(diǎn)選自所述第一參考序列的第12密碼子和第13密碼子；

所述第二目標(biāo)靶點(diǎn)選自所述第二參考序列的第6和第10個(gè)CpG位置。