[發明專利]用于虎斑、擬目與劍尖槍烏賊種間鑒定的分子標記及應用

在審

• 申請號: 201810270801.8
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108611422A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發明（設計）人: 宋微微;趙云;王春琳;李榮華;母昌考
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 張一平;葉桂萍

本發明涉及一種用于虎斑、擬目與劍尖槍烏賊種間鑒定的分子標記及應用，為屬于近緣種鑒定技術，具體的說是一種烏賊近緣物種鑒定的方法。具體為以虎斑、擬目與劍尖槍烏賊基因組DNA為模板，根據虎斑、擬目與劍尖槍烏賊物種基因組的標簽序列設計引物進行PCR擴增，利用擴增產物在高分辨率熔解曲線(HRM)中的Tm值差異進而區分烏賊物種；采用本發明能夠快速、經濟、簡便的進行物種之間的鑒定，與標簽序列測序結果相比較準確率為100％。

技術領域

本發明屬于烏賊物種鑒定技術領域，尤其涉及一種可用于虎斑烏賊、擬目烏賊與劍尖槍烏賊種間鑒定的分子標記及應用。

背景技術

虎斑烏賊(Sepia pharaonis)隸屬軟體動物門(Mollusca)、烏賊目(Sepioidea)、烏賊科(Sepiidae)、烏賊屬(Sepia)。分布于印度太平洋的熱帶海域，自近岸至水深100m的水域中均有發現。擬目烏賊(Sepia lycidas)隸屬頭足綱(Cephalopoda)、烏賊目(Sepioidea)、烏賊科(Sepiidae)、烏賊屬(Sepia)，是淺海暖水性較強的底棲種，棲息在大陸架區15～100m水深的近海水域，分布在印度洋-西太平洋海域。劍尖槍烏賊(Loligoedulis)俗稱紅魷魚,屬槍烏賊科,槍烏賊屬,淺海性暖水種,分布于東海、南海、日本群島南部近海,菲律賓群島至澳大利亞北部海域。東海主要分布在大陸架外緣海域,是20世紀90年代初新開發的頭足類資源之一,年產量約(2～3)×10⁴t,是重要的水產品。我國東海水域均有分布這三種烏賊，三種烏賊均有營養豐富、美味可口，廣受消費者喜愛。目前，水產品市場上售賣的烏賊多以未冰凍的新鮮死烏賊產品方式和加工方式進行售賣，因為烏賊具有應激噴墨的習性而導致市場上售賣的烏賊因帶墨而模糊不清，且死亡后的烏賊種間表型差異縮小，常見的形態學特點差異消失；且加工過后，肢體完整性較差，無法依據局部來進行整體判別。總體而言，依靠形態分類鑒定難度較大，并且易產生很多分歧，單靠形態學難以區分。因此，選用有效的方法來區分虎斑烏賊、擬目烏賊與劍尖槍烏賊具有重要意義；近年來，隨著分子生物學的發展，利用分子生物學手段來鑒定物種已經逐漸成為一種趨勢，并為大多數的生物學家所接受。自美國學者Lander于1996年提出繼RFLP、SSR的第三代新型分子標記技術——SNP以來，SNP的檢測和分型已成為遺傳學研究的關鍵技術，SNP指的是某種生物不同個體DNA序列中單個核苷酸點突變產生的多態性，包括置換、顛換、插入或缺失引起的多態現象。SNP是由。而高分辨率熔解曲線法是基于不同核酸物理性質的差異，將熒光染料加入PCR反應體系，當含熒光染料的DNA解旋后，便可收集熒光信息形成熔解曲線。當DNA序列中某個堿基發生變化，熔解曲線便會發生相應的改變，便可通過軟件對遺傳信息進行分析，其具有高效、精確、高通量、低成本等優點。目前，HRM技術已被應用于已知基因型的鑒定，突變篩查，DNA甲基化分析，微生物的分子分型與鑒定和RNA編輯等領域，是分子診斷中的熱門技術。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種可用于虎斑、擬目與劍尖槍烏賊種間鑒定的分子標記。

本發明所要解決的另一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種利用上述分子標記來區分虎斑、擬目與劍尖槍烏賊種間鑒定的應用。

本發明所要解決的又一個技術問題是針對現有技術的現狀提供一種利用上述分子標記來區分虎斑、擬目與劍尖槍烏賊種間鑒定的方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：該可用于虎斑、擬目與劍尖槍烏賊種間鑒定的SNP分子標記，其特征在于：所述SNP分子標記的

正向引物F1為5'CTTAGTACAGTTAAAATACCGCAGC 3'；

反向引物F2為5'TAAATAAAGAGTTGGGCCTGCTC 3'。

本發明為解決第二個技術問題提供一種利用上述SNP分子標記在基于高分辯率溶解曲線鑒定虎斑、擬目與劍尖槍烏賊中的應用。