[發明專利]一種用于假肉監測的檢測方法

在審

• 申請號: 201810270769.3
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108531547A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 周斌;王樹明
• 申請（專利權）人: 杭州泰熙生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6888
• 代理公司: 浙江杭知橋律師事務所 33256
• 代理人: 王梨華;陳麗霞

1.一種用于假肉監測的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，樣品DNA提取

50mg肉組織用液氮研磨成粉，加入1mL細胞裂解液；樣品在55℃恒溫過夜；溶解產物轉移至離心管，加入1mL的Tris飽和酚和1mL的8-羥基喹啉，混勻輕搖10min后進行第一次離心后取第一水相，用第一水相1/2體積的Tris飽和酚萃取后進行第二次離心后取第二水相，加入第二水相1/2體積的氯仿，混勻30s后進行第三次離心取第三水相；將第三水相轉移至另一離心管，用均為第三水相1/20體積、濃度為3mol/L的醋酸鈉和無水乙醇沉淀后進行第四次離心，棄上清，得到的沉淀物用70％的乙醇清洗，干燥后溶于100μL TE緩沖液中得到DNA提取物，該提取物即為DNA模板，用超微量核酸蛋白分析儀測定模板DNA的質量和濃度；

細胞裂解液為Tris-HCl、乙二胺四乙酸、NaCl、蛋白酶K、十二烷基硫酸鈉、核糖核酸酶組成的混合液，其中Tris-HCI的濃度為50mmol/L、pH為8.0，乙二胺四乙酸的濃度為10mmol/L、pH為8.0，NaCl的濃度為100mmol/L，蛋白酶K的濃度150μg/mL，十二烷基硫酸鈉的質量分數為2％，核糖核酸酶的體積為10μL；TE緩沖液的組成為10mL、濃度為1mol/L、pH為8.0的Tris-HCl和2mL、濃度為500mmol/L、pH為8.0的乙二胺四乙酸混合，之后加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌20min；

步驟二，根據牛、山羊、豬、雞線粒體基因，應用CLUSTALW1.83軟件和BLAST軟件進行序列比較，用Primer Premier 5.0設計一條公用上游引物，再根據種屬間的差異設計各自的特異下游引物，建立反應體系，反應體系為：25μL由10×SYBR Green I，3.0μL DNA模板，15μL Isothermal MasterMix Iso-001，上游引物與4條下游引物各0.5μL組成。

2.根據權利要求1所述的用于假肉監測的檢測方法，其特征在于：第一次離心、第二次離心的離心條件：溫度為15℃、轉速為10000rpm，離心時間為10min；第三次離心、第四次離心的離心條件：相對離心場為1200g，離心時間為15min。

3.根據權利要求1所述的用于假肉監測的檢測方法，其特征在于：上游引物序列為5'-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'，下游引物序列為：牛5'-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3'；山羊5'-CTCGACAAATGTGAGTTACAGAGGAA-3'；豬5'-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA-3'；雞5'-AAGATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3'。

4.根據權利要求1所述的用于假肉監測的檢測方法，其特征在于：牛、山羊、豬、雞的特異性擴增產物片段分別為274bp，157bp，398bp，227bp。

5.根據權利要求1所述的用于假肉監測的檢測方法，其特征在于：反應體系的反應條件為95℃預變性3min；40個循環：95℃變性30s，58～68℃退火30～50s，72℃延伸30s。

6.根據權利要求5所述的用于假肉監測的檢測方法，其特征在于：反應體系的反應條件為95℃預變性3min；40個循環：95℃變性30s，59℃退火31s，72℃延伸30s。