[發明專利]一種水蛭細胞體外培養基及其培養方法

有效

• 申請號: 201810268999.6
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108265021B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 虞龍
• 申請（專利權）人: 蘇州至匯生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 南京新慧恒誠知識產權代理有限公司 32424
• 代理人: 王月霞

本發明公開了一種水蛭細胞體外培養基及其培養方法，將剪碎后的水蛭組織塊接種于細胞封閉培養瓶中，加入Insect?CCulture昆蟲細胞培養基，細胞培養箱中靜置培養，再配合組織塊回收法進行分離培養，最后通過胰酶消化法獲得純化的水蛭體細胞進一步培養。與其他昆蟲細胞培養基相比更加快速成功的獲得水蛭純化體細胞，為進一步進行水蛭細胞體外傳代培養做準備，并且建設一套體外原代培養水蛭細胞體系。

技術領域

本發明涉及一種水蛭胞體外培養方法，屬于生物工程領域。

背景技術

隨著生命科學的迅速發展，不論對于整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，并推動著細胞生物學、分子生物學、生物化學等領域的發展。

水蛭（Whitmania pigra Whitman）屬于環節動物門蛭綱水蛭科，據統計，分布在全世界的蛭類動物共有600多種，分布在我國的也有近100種。水蛭屬冷血環節動物，在中國南北方均可生長繁殖，它主要生活在淡水中的水庫、溝渠、水田、 湖沼中，以有機質豐富的池塘或無污染的小河中最多。生長適溫為10-40℃，北方地區低于3℃時在泥土中進入蟄伏 冬眠期，次年3-4月份高于8℃左右出蜇活動。水蛭為雜食性動物，以吸食動物的血液或體液為主要生活方式，常以水中浮游生物、昆蟲、軟體動物為主餌，人工條件下以各種動物內臟、熟蛋黃、配合飼料、植物殘渣，淡水螺貝類、雜 魚類、 蚯蚓等作餌。

研究發現，水蛭唾液腺分泌物中含有水蛭素等多種生物活性物質并且在醫藥上具有廣闊應用前景。水蛭素、水蛭透明質酸酶、安替斯塔辛、麻醉劑、血管擴張劑、前列腺素等，具有降血脂、保護心腦血管、抗凝血和抗腫瘤等功效，具有重要的研究意義。因此，臨床上對天然水蛭素需求很大。現有的水蛭素提取主要是生物工程手段重組合成和刺激水蛭唾液腺分泌水蛭素，這兩種方法不僅成本高而且所得到的水蛭素產量也極低。隨著細胞體外培養技術的發展，通過體外培養水蛭細胞獲得水蛭素成為一項熱門的研究課題，研究發現從這種方法中獲得的水蛭素不僅產量高同時其效果可以與刺激水蛭唾液腺分泌所得的水蛭素相媲美。但是，目前水蛭細胞體外培養技術還處于萌芽階段，其培養基的選擇、培養條件的確定、抗生素的選擇等等都是急需攻克的難題。

發明內容

針對上述問題，本發明提供一種水蛭細胞體外培養方法。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種水蛭細胞體外培養基，其特征在于，所述培養基配方如下：

無機鹽：

NaCl1420mg/L，ZnCL₂ 876.54mg/L，MgSO₄·7H₂O1743.48mg/L，KCl2080mg/L，KH2PO₄·2H₂O 1000mg/L；

氨基酸：

DL-絲氨酸9000mg/L，甘氨酸620mg/L，L-精氨酸鹽酸鹽700mg/L，L-天冬酰胺400mg/L，L-天冬氨酸350mg/L，L-半胱氨酸二鹽酸鹽160mg/L，L-谷氨酸3500mg/L，L-組氨酸鹽酸鹽2000mg/L，L-異亮氨酸200mg/L，L-亮氨酸150mg/L，L-賴氨酸鹽酸鹽850mg/L，L-甲硫氨酸100mg/L，L-苯丙氨酸100mg/L，L-脯氨酸500mg/L，L-蘇氨酸200mg/L，L-色氨酸150mg/L，L-酪氨酸磷酸氫二鈉580mg/L，L-纈氨酸200mg/L，?-丙氨酸400mg/L，L-丙氨酸225mg/L；

維生素：

D-生物素0.15mg/L，D-泛酸鈣0.15mg/L，葉酸鹽0.15mg/L，氰鈷胺0.10mg/L，煙酸0.15mg/L，鹽酸吡哆胺0.15mg/L，核黃素0.15mg/L，硫胺素0.10mg/L，對氨基苯甲酸0.15mg/L；

其它：