[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于熒光定量系統(tǒng)的LAMP定量方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810265404.1
• 申請(qǐng)日: 2018-03-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108384837A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊璐溪;李曉燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廈門(mén)藍(lán)特生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6851
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種基于熒光定量系統(tǒng)的LAMP定量方法，該方法利用熒光定量PCR儀實(shí)現(xiàn)LAMP定量，采用2種常用熒光染料測(cè)試LAMP反應(yīng)，并對(duì)染料濃度進(jìn)行篩選確定，具體包括以下內(nèi)容：

Evagreen染料濃度的優(yōu)化，該染料低濃度對(duì)PCR及LAMP抑制作用較小，優(yōu)化濃度梯度為：0.2X, 0.6X, 1.0X, 1.4X, 1.8X, 2.2X；

SYTO-82染料濃度的優(yōu)化，SYTO-82是一種穩(wěn)定性高，信噪比低的熒光染料，低濃度對(duì)PCR及LAMP抑制作用較小，優(yōu)化濃度梯度為：45μM, 35μM, 25μM, 15μM, 5μM, 2.5μM；

本發(fā)明建立的LAMP定量體系為：總體積20μL，包括：1x Thermopol buffer (20 mMTris-HCl，(pH8.8)，10 mM KCl，10 mM (NH₄)2SO₄，2 mM MgSO₄，0.1%.Triton X-100)，6 mMMgSO₄，1.4 mM dNTPs，0.8 M 甜菜堿，0.2μM外引物（tcdA-F3,tcdA-B3），1.6μM 內(nèi)引物（tcdA-FIP,tcdA-BIP），0.8μM環(huán)引物（tcdA-LB），320 U/mL Bst DNA 聚合酶，0.2X-2.2XEvagreen 或2.5-45μM SYTO-82，模板DNA 1μL，ddH₂O補(bǔ)足至20μL；

LAMP熒光定量檢測(cè)程序?yàn)椋?3℃ 15s； 63℃ 30s，63℃ 30s，60個(gè)循環(huán)；95℃ 2min；25℃，2min。