[發明專利]同時表達兩個外源蛋白載體TRVe2

有效

• 申請號: 201810261990.2
• 申請日: 2018-03-28
• 公開（公告）號: CN108486147B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: 廖乾生;常發光;杜志游;劉小紅;林福呈
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學;浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.同時表達兩個外源蛋白載體TRV2e²的構建方法，其特征是：以TRV的基因組RNA2的農桿菌侵染性克隆pYL156為材料，構建含有TRV的2b基因啟動子和豌豆早枯病毒外殼蛋白基因啟動子序列的載體，通過這2個植物病毒的基因組啟動子驅動外源基因在本氏煙中表達；

依次包括以下步驟：

以質粒pYL156為模板，通過引物對P1/P2進行PCR擴增，目的產物割膠回收后經HindⅢ/EcoRⅠ雙酶切，同時用Hind Ⅲ/EcoRⅠ對pYL156進行雙酶切，割膠回收載體，與上一步所得酶切PCR產物片段連接及轉化，獲得重組質粒pTRV2e¹；P1和P2引物序列分別為cccAAGCTTGCATGCCTGCAG和cGAATTCtctagaCTCGAGacgcgtAAGCCACTTCCTAAGTAATTCGTGCcTTGCGAAACTCAAATGC；

PCR擴增的體系為： 5×Q5 reaction buffer 8 μL， 2.5 mM的 dNTP 3.2 μL，10 μM的P1/P2各2 μL，模板pYL156 10 ng， 1U/ μL的 Q5 polymerase 0.4 μL，ddH₂O補足至40 μL；PCR反應程序為：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，35個循環，72 ℃ 5min；

豌豆早枯病毒外殼蛋白CP基因啟動子序列為：gcacacaaggttaaaaacgctgtagtaatacatgcgcaagaacaggctgagcatcttgttctggggtttcacactatctttagagaaagtgttaagttaattaagttatcttaattaagagcataattatactgatttgtctctcgttgatagagtctatcattctgttactaaaaatttgacaactcggtttgctgacctactggttactgtatcacttacccgagttaacgagatct，通過人工合成并克隆于載體pUC57中；以載體pUC57-PEBV CP為模板，通過引物對P3/P4進行擴增得到PEBV CP的啟動子序列，目的片段割膠回收，經MluⅠ/SmaⅠ雙酶切清潔回收后，并克隆至pTRV2e¹中，獲得克隆pTRV2e²；引物P3和P4分別為CGacgcgtGCACACAAGGTTAAAAACGCTGTAG和tccCCCGGGccatggGGTACCggatccTCACTGAGGTGCCTCGATG；

PCR擴增的體系為： 5×Q5 reaction buffer 8 μL， 2.5 mM 的dNTP3.2 μL ，10 μM的P3/P4各2 μL，模板pUC57-PEBV CP 10 ng， 1U/ μL的 Q5 polymerase0.4 μL，ddH₂O補足至40 μL；PCR反應程序為：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35個循環，72 ℃ 5 min。

2.如權利要求1所述方法構建所得外源蛋白表達載體pTRV2e¹和pTRV2e²的用途，其特征是：病毒TRVe¹和TRVe²在寄主植物中不引起明顯的癥狀；攜帶2個外源基因病毒TRVe²后能系統性擴展至整個植株，并在同一個細胞中表達2個外源蛋白；

所述TRVe¹由pTRV1和 pTRV2e¹組成，所述TRVe²由pTRV1和 pTRV2e²組成。