[發明專利]HPV16-HPV18重組序列、包含其的質粒及其應用

在審

• 申請號: 201810261842.0
• 申請日: 2018-03-28
• 公開（公告）號: CN108342406A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 李祥;鄒立林
• 申請（專利權）人: 寧波市凱美生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/6851
• 代理公司: 南京品智知識產權代理事務所(普通合伙) 32310
• 代理人: 奚曉寧

1.一種HPV16-HPV18重組序列，序列如SEQID NO.1所示。

2.含有權利要求1所述重組序列的質粒，其特征在于：將SEQID NO.1所示序列插入到pAC57質粒中構建而成。

3.如權利要求2所述的質粒，其特征在于：所述質粒是將pAC57質粒經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切消化后，與上游加入EcoRⅠ酶切位點、下游加入HindⅢ酶切位點、如SEQID NO.2所示的HPV16 DNA保守序列，和上游加入HindⅢ酶切位點、下游引入BamHⅠ酶切位點、如SEQID NO.3所示的HPV18 DNA保守序列，在連接酶作用下進行連接而成。

4.如權利要求2所述的質粒，其特征在于所述質粒是由如下方法制備得到：

步驟(1)：提取HPV16DNA和HPV18 DNA，PCR擴增，

其中，HPV16 DNA擴增的上游引物序列為：

CGGAATTCGACGACTATCCAGCGACCAAG，CGGAATTC為保護堿基及EcoRⅠ酶切位點，

下游引物序列為：

CCAAGCTTTGAGGATTGGAGCACTGTCC，CCAAGCTT為保護堿基及HindⅢ酶切位點；

HPV18擴增的上游引物序列為：

CCAAGCTTGGGTGACACTGTGCCTCAATCC，CCAAGCTT為保護堿基及HindⅢ酶切位點，

下游引物序列為：

CGGGATCCTTGGAGAGGGAGAATACACAC，CGGGATCC為保護堿基及BamHⅠ酶切位點；

步驟(2)：將HPV16 DNA PCR擴增產物經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切消化，HPV18 DNA PCR擴增產物經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切消化，pAC57質粒經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切消化；

步驟(3)：將步驟(2)所得消化產物純化后在連接酶作用下進行連接即得。

5.權利要求1所述的重組序列和權利要求2至4任一項所述的質粒在檢測HPV16 DNA和/或HPV18 DNA中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于：權利要求1所述的重組序列和權利要求2至4任一項所述的質粒作為實時熒光PCR檢測HPV16 DNA和/或HPV18 DNA的參考標準品或陽性質控品。

7.如權利要求5所述的應用，其特征在于包括以下步驟：

步驟a：配制一系列濃度的含有本發明HPV16-HPV18重組序列質粒的標準溶液；

步驟b：分別以步驟a中不同濃度的含有本發明HPV16-HPV18重組序列質粒的標準溶液為模板，以GACGACTATCCAGCGACCAAG為上游引物，以TGAGGATTGGAGCACTGTCC為下游引物，以FAM-CGGAAACCCCTGCCACAC-MGB為探針，實時熒光PCR，以濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，制得HPV16 DNA檢測標準曲線；和/或分別以步驟a中不同濃度的含有本發明HPV16-HPV18重組序列質粒的標準溶液為模板，以GGGTGACACTGTGCCTCAATCC為上游引物，以TTGGAGAGGGAGAATACACAC為下游引物，以VIC-CAGGTGAAGCACGCATA-MGB為探針，實時熒光PCR，以濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標，制得HPV18 DNA檢測標準曲線；

步驟c：提取待測樣品的HPV16DNA，同步驟b的方法進行實時熒光PCR，根據步驟b制得的HPV16 DNA檢測標準曲線得到待測樣品HPV16DNA濃度；和/或提取待測樣品的HPV18DNA，同步驟b的方法進行實時熒光PCR，根據步驟b制得的HPV18 DNA檢測標準曲線得到待測樣品HPV18DNA濃度。