[發明專利]一種無血清細胞凍存液

在審

• 申請號: 201810257683.7
• 申請日: 2018-03-27
• 公開（公告）號: CN108450458A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 張楠;蘇超;李燕雛;李琪;阮秀娟
• 申請（專利權）人: 成都菱祐生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 成都創新引擎知識產權代理有限公司 51249
• 代理人: 柴越

本發明公開了一種無血清細胞凍存液，屬于細胞培養領域。本發明所述的無血清凍存液組成為：CD培養基(化學成分限定培養基，Chemically Defined Media)90?99％、細胞培養級二甲基亞砜(DMSO)1?10％。這種凍存液不含有動物源血清，不會引入外源蛋白，降低了動物病源污染的可能性，凍存細胞復蘇后活性可達到80％?90％，細胞表型基本沒有變化，從而保持了細胞復蘇后的生理功能和生物學功能，可用于繼續培養或臨床直接回輸。這種無血清凍存液安全有效，制備方法簡單，成本可控，具有良好的臨床應用前景。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，具體地，涉及一種無血清細胞凍存液。

背景技術

細胞凍存及復蘇是細胞培養技術中的重要技術，細胞凍存是細胞長期保存的重要手段。細胞凍存液，作為細胞凍存時必須使用的一種溶液，其作用是將需要凍存的細胞懸浮于凍存液，供給細胞生命代謝所必須的營養物質，同時可以防止或減少冷凍冰晶對細胞的損傷作用。在現有技術中，一般使用培養基、血清和二甲亞砜(DMSO)按照一定比例混合的方法來凍存細胞，DMSO用量為10％，過低的DMSO濃度會導致凍存效果欠佳，但高濃度的DMSO有較大毒性，會對細胞體造成傷害；且傳統凍存液配方中所使用的血清成本高，增加動物病原污染的可能性。此外，有研究表明長期與胎牛血清接觸的細胞會對溶液介質中的胎牛血清發生內吞，內吞胎牛血清后的間充質干細胞有可能發生某些蛋白表達的變化，應用于人體后可發生異種動物蛋白引起的免疫反應，不能直接用于臨床輸注。因此，利用含有血清的凍存液凍存的細胞會給臨床使用帶來一定的風險。

而目前市售無血清凍存液所使用的血清與DMSO替代物包括甘油、殼聚糖以及海藻酸，所使用無血清培養基包括粘附因子、結合蛋白、生長因子、微量礦物元素、荷爾蒙、維生素，其添加物成分復雜，配制麻煩；本發明所提供細胞無血清凍存液所使用培養基為CD培養基，并在此基礎上大大降低了凍存液中DMSO含量，使其毒性降低，且無需使用成分復雜的DMSO代替物。

發明內容

本發明的目的在于：針對上述存在的問題，提供一種無血清細胞凍存液，本發明克服了傳統血清凍存液含有動物源血清或高濃度DMSO的缺陷，經濟有效，且不會引入外源污染。用本發明的凍存液凍存的間充質干細胞及其他各類腫瘤細胞，細胞形態保存完好，具有很強的存活率和貼壁能力。

本發明是通過以下技術方案如下實現的：

一種無血清細胞凍存液，包括以下組分：CD培養基和二甲基亞砜(DMSO)，所述CD培養基包含氨基酸、維生素、無機鹽和水；所述維生素包括維生素B、維生素C和維生素D中的至少一種；所述CD培養基的具體配制方法為：稱量不含有任何血清，動物源蛋白的化學限定培養基粉末到無菌玻璃容器中，加入高壓滅菌RO水，充分攪拌，待粉末完全溶解后利用無菌的0.5-2.0mol/L的NaOH調節PH為7.0-7.5，經0.22μm過濾器過濾后即制得CD培養基。

進一步地，所述CD培養基的質量體積比為90-99％，所述二甲基亞砜(DMSO)的體積百分數1-10％，按以下體積份量進行配制：

CD培養基100份；

二甲基亞砜1-10份。

具體地，在生物安全柜無菌環境中取4℃保存的CD培養基100份，水浴環境下升溫至室溫；在生物安全柜無菌環境中取二甲基亞砜1-10份；在常溫、安全柜無菌環境中混合CD培養基和二甲基亞砜，配置成終濃度為含90-99％CD培養基及1-10％二甲基亞砜的凍存液。

進一步地，所述氨基酸包括賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、、脯氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸中的至少一種。

進一步地，所述無機鹽包括鈣、磷、鉀、鈉、氯、鎂、硫的磷酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽和鹽酸鹽中的至少一種。