[發明專利]一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法

有效

• 申請號: 201810252408.6
• 申請日: 2018-03-26
• 公開（公告）號: CN108410823B
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發明（設計）人: 俞君英;張健;董成友;張穎
• 申請（專利權）人: 安徽中盛溯源生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 合肥和瑞知識產權代理事務所(普通合伙) 34118
• 代理人: 王挺

1.一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，包括如下步驟，

1）、從人類血液細胞中抽提單核細胞，通過擴增培養基進行選擇性培養，獲取紅細胞祖細胞；

2）、將表達外源重編程因子的微環游離型載體導入步驟1）中獲取的紅細胞祖細胞；

3）、將步驟2）中獲取的含有表達外源重編程因子的微環游離型載體紅細胞祖細胞經多能干細胞誘導培養基培養，在無飼養層體系中誘導成重編程中間態細胞；

4）、待完全誘導后，更換步驟3）中所述的多能干細胞誘導培養基為多能干細胞培養基維持培養，獲得外源重編程因子表達消失且內源多能性基因POU5F1、NANOG、TRA-1-60與TRA-1-81表達激活的細胞，該細胞即為iPSC；

所述微環游離型載體的制備方法包括如下步驟，

S1、用微環DNA親本質粒轉化宿主菌，該宿主菌內含有表達單向位點特異性重組酶的基因，該微環DNA親本質粒中包含用于誘導紅細胞祖細胞成為多能干細胞的外源重編程因子；

S2、誘導S1中宿主菌內單向位點特異性重組酶的表達；

S3、使S1中的微環DNA親本質粒與S2中的單向位點特異性重組酶接觸，發生位點特異性重組產生微環游離型載體；

所述外源重編程因子選自蠑螈OCT4轉錄因子和其他轉錄因子，其他轉錄因子選自NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53 knockdown、MIR302/367 cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1和SV40LT轉錄因子中的任意一種或者任意幾種的組合。

2.根據權利要求1所述的一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，單向位點特異性重組酶及其作用位點選自Cre重組酶/LoxP、Flp重組酶/FRT、ФC31整合酶/attB和attP中任意一種。

3.根據權利要求2所述的一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述的單向位點特異性重組酶是ФC31整合酶，其整合酶作用的重組位點為attB和attP。

4.根據權利要求1所述的一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微環游離型載體包括依次連接的DNA復制啟動子以及作用于該DNA復制啟動子的反式作用因子、轉錄調控元件、重編程因子編碼序列和polyA加尾信號。

5.根據權利要求4所述的一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述DNA復制啟動子來源于EB病毒、Kaposi's肉瘤皰疹病毒、松鼠猴皰疹病毒、馬立克式病毒的oriP。

6.根據權利要求4所述的一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述反式作用因子為一種EBV nuclear antigen 1。

7.根據權利要求1所述的一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述人類血液細胞來源于人外周血、臍帶血和骨髓血中的任意一種。

8.根據權利要求1所述的一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述步驟1）中的擴增培養基、步驟3）中的多能干細胞誘導培養基和步驟4）中的多能干細胞培養基均為化學成分明確的培養基。

9.根據權利要求1所述的一種微環游離型載體高效重編程血液細胞生成iPSC的方法，其特征在于，所述微環DNA親本質粒還含有細菌序列。