[發(fā)明專利]一種血漿miRNA的qRT-PCR檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810251652.0
• 申請日: 2018-03-26
• 公開（公告）號: CN108330183A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李富榮;王勇;劉鷹;戴蘡瓔;衛(wèi)志堅
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市展行生物有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種血漿miRNA的qRT-PCR檢測方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)標本收集：使用5mlEDTA真空采血管抽取空腹靜脈血4ml，采血后輕輕顛倒試管，混合8-10次，不得劇烈震蕩，采完血樣后樣本垂直放置，使用臺式低俗低溫離心機3500rpm離心10min分離得到血漿，樣本無肉眼可見溶血，剔除所有溶血可能的血漿樣本，每200μL分裝到一個凍存管，隨后存放于-80℃冰箱待用，盡量減少凍融次數(shù)，全程需在抽血后2小時內(nèi)完成；

2)滴加miRNA提取液：100μl血漿里加入1ml miRNA提取液，反復(fù)吹打至析出物完全溶解；

3)滴加氯仿：加入200μl氯仿，蓋緊EP管管蓋，劇烈振蕩20秒，室溫靜置5分鐘；

4)第一次離心：冷凍離心機12000g，4℃條件下離心15分鐘，此時勻漿液分為三層：上層為含miRNA上清液，中間為白色蛋白層，下層為有色有機相；

5)移液：吸取500μl上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中；

6)滴加miRNA提取液和異丙醇：加入5μl miRNA提取液和等體積的異丙醇(505μl)，上下顛倒充分混勻，-20℃靜置10分鐘；

7)第二次離心：冷凍離心機13500g，4℃條件下離心10分鐘；

8)滴加乙醇：棄上清，向沉淀加入1ml75％乙醇，輕緩顛倒清洗沉淀；

9)第三次離心：冷凍離心機13500g，4℃條件下離心5分鐘，棄上清；

10)滴加RNase-free水：室溫干燥2-3分鐘，加入20μl RNase-free水溶解；

11)配置加尾及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：將0.001-1μg Total RNA，2.5μl 4×ReactionBuffer Mix，1μl PolyA/RT Enzyme Mix；1μl 10×miRNA RT primer**，6-10μl RNase-free Water和10μl Total volume混合均勻后，于37℃保溫30min，42℃保溫30min，75℃加熱5min，冰上放置5min，制成加尾及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系；

12)配置熒光定量PCR反應(yīng)體系：將5μl 4×PCR Buffer，0.4μl HS SM-Taq，0-0.2μlRox Reference Dye(100×)，1μl 20×probe&miRNA PCR primer，Xμl cDNA，10-20μl dH2O和20μl Total volume混合均勻后，制成熒光定量PCR反應(yīng)體系；

13)進行定量檢測：將處理后的血漿、加尾及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和熒光定量PCR反應(yīng)體系依次加入到八聯(lián)管中，在95℃下反應(yīng)3min，并循環(huán)反應(yīng)1次，記錄數(shù)據(jù)，接著再95℃下反應(yīng)10s，并循環(huán)反應(yīng)40次，記錄數(shù)據(jù)，最后在60℃下反應(yīng)30s，并循環(huán)反應(yīng)40次，記錄數(shù)據(jù)；

14)讀取和記錄數(shù)據(jù)：每個反應(yīng)重復(fù)三次,讀取和記錄數(shù)據(jù)；

15)數(shù)據(jù)分析：對測試數(shù)據(jù)進行分析，確定測試結(jié)果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種血漿miRNA的qRT-PCR檢測方法，其特征在于：所述步驟12)中DNA加入量建議不要超過熒光定量PCR反應(yīng)總體積的1/20(V/V)，如果需要單獨加入cDNA，將cDNA稀釋5-20倍，然后取5μl加入熒光定量PCR反應(yīng)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的一種血漿miRNA的qRT-PCR檢測方法，其特征在于：所述步驟13)中miRNA成熟序列的GC含量較高，可將反應(yīng)溫度升高3-5℃。