[發明專利]一種利用CRISPR/Cas9技術敲除Endoglin基因的方法

在審

• 申請號: 201810243301.5
• 申請日: 2018-03-23
• 公開（公告）號: CN108384784A
• 公開（公告）日: 2018-08-10
• 發明（設計）人: 趙永祥;鐘莉娉;陽諾
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/90;C12N5/10;A61K35/13;A61P35/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 韋肖燕

本發明公開一種利用CRISPR/Cas9技術敲除Endoglin基因的方法，屬于基因工程、免疫學和腫瘤學技術領域。所述方法含有針對Endoglin基因敲除的CRISPR/Cas9的gRNA序列；所述序列如SEQ ID NO:1序列；所述針對Endoglin基因敲除的CRISPR/Cas9的gRNA序列的設計選擇在第一外顯子。本發明進一步研究了Endoglin在惡性腫瘤細胞發生、發展及轉移過程中不可或缺的作用，并探討利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對小鼠肝癌模型進行治療的效果，為臨床的腫瘤治療提供一種新的思路。

技術領域

本發明屬于基因工程、免疫學和腫瘤學技術領域，特別涉及一種利用CRISPR/Cas9技術敲除Endoglin基因的方法及其應用。

背景技術

腫瘤(Tumor) 是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，導致其克隆性異常增生而形成的異常病變而產生的，20世紀后期近30年以來，癌癥發病一直呈上升的趨勢，據世界衛生組織(WHO)報告,1990年全球癌癥新發病例數約807萬，比1975年的517萬增加了37.4%，而1997年全球的癌癥死亡數約620萬，并且按目前的趨勢預測，至2020年隨著世界人口達80億，將有2000萬新發癌癥病例，其中死亡人數將達1200萬，且其中絕大部分將發生在發展中國家；幾十年來，由于生態環境的不斷惡化、艾滋病等疾病的傳播，惡性腫瘤的發病率呈上升趨勢，并成為繼心血管疾病之后的第二大致死病因，特別是肝癌，是威脅全世界人類健康及生命重要的因素之一，其中又以實體腫瘤最多見。實體腫瘤的發生、增長以及轉移的基礎是源于腫瘤內血管的形成和發展，是腫瘤細胞進行新陳代謝途徑的關鍵。腫瘤血管的形成主要包括兩個階段，即腫瘤血管形成前期和血管形成后期。在腫瘤血管形成前期，腫瘤細胞僅僅依靠單純的細胞增殖能力進行平穩的增殖，單純擴散的方式進行營養物質的攝取與代謝產物的排放，形成無血管結構的細胞團，因此腫瘤的增殖能力較弱，腫瘤僅僅能夠生長至幾立方毫米左右，當這種簡單的物質代謝途徑不能滿足腫瘤增長時，腫瘤即進入一個相對靜止的增長期。在腫瘤血管形成后期，腫瘤細胞可以釋放多種細胞因子，從而誘導腫瘤血管的形成，在機體本身的血管組織向腫瘤部位發出毛細血管幼芽，當形成腫瘤新生血管時，腫瘤細胞的營養供給充足，進入對指數生長階段，并且通過血管對腫瘤細胞向向鄰近組織進行輸送，發生轉移。由此可見，腫瘤中微血管形成越多，腫瘤的生長速度越快，轉移及擴散越廣泛，因此發現一種可靠的血管標志物來作為腫瘤臨床診斷及治療的依據。

基因編輯技術（Gene Editing Technology），作為人們研究基因功能的主要方法，近年來一直飛速發展，而CRISPR/Cas9基因編輯技術和轉錄激活因子樣效應子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）技術作為近幾年的熱門技術，是眾多學者研究和應用的對象。規律間隔的短回文重復序列（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR）簡稱CRISPR序列，其系統主要由兩部分構成為重復序列和間隔序列交替排列所形成的CRISPR基因座和其上游的Cas蛋白家族的操縱子。其中，CRISPR基因座中的間隔序列(protospacers)源自于細菌對外源性DNA的拷貝，具有特異性識別外源性DNA的功能。

Endoglin是一種胞膜形成所必須的蛋白質，主要在人類內皮細胞表面和胎盤滋養層細胞表面表達。有研究表明，在增殖活躍的腫瘤細胞中可以檢測到Endoglin的高表達，同時也有研究在臨床樣本檢測及動物實驗中得出結論，在新生血管內皮細胞表面Endoglin表達程度明顯升高，尤其是在內皮細胞增至狀態良好，呈對指數增長時高表達，因此通過以上研究表明，Endoglin可以作為新生血管內皮細胞的主要標志，而且Endoglin的表達程度的高低可以用來衡量血管內皮細胞的增至狀態。

因此，提出一種利用CRISPR/Cas9技術敲除Endoglin基因的方法及其應用是本領域技術人員研究的新的思路。

發明內容