[發明專利]麥草畏中間產物3;6-二氯龍膽酸脫氯酶DsmH2及其編碼基因的應用

有效

• 申請號: 201810242125.3
• 申請日: 2018-03-22
• 公開（公告）號: CN108441503B
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發明（設計）人: 何健;李娜;姚利;丁德榮;陶青;陳樂;劉斌;彭乾
• 申請（專利權）人: 南京農業大學;北京大北農生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N9/14;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/82;B09C1/10;C02F3/34;C12R1/19;C02F101/36
• 代理公司: 32218 南京天華專利代理有限責任公司
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

本發明公開了麥草畏中間產物3,6?二氯龍膽酸脫氯酶DsmH2及其編碼基因的應用。dsmH2其核苷酸序列為SEQ ID NO.1，全長741bp，編碼246個氨基酸，其氨基酸序列為SEQ ID NO.2。DsmH2是首次發現參與麥草畏下游代謝路徑的谷胱甘肽硫轉移酶類型的還原脫氯酶，能在30min內降解100mg/l的3,6?二氯龍膽酸。因此，3,6?二氯龍膽酸脫氯酶基因dsmH2在構建降解麥草畏轉基因作物中應用潛能巨大。

技術領域

本發明屬于環境微生物和農業領域，涉及參與除草劑麥草畏微生物降解過程中的兩個脫氯酶及其編碼基因的應用。

背景技術

農藥是指應用于防治危害農作物的病蟲、雜草等有害生物以及調節植物生長的化學試劑的總稱，是保障現代農業生產力的重要手段，合理使用農藥可以有效的防治作物病害，提高作物產量。除草劑的使用能有效減輕農業勞動強度，提高作物產量，但是隨著除草劑的大量和長期使用，其殘留對大氣、土壤及水體造成的危害越來越嚴重，同時對人類健康造成威脅。農藥污染修復技術可分為物理降解(熱降解、光降解)、化學降解和生物降解。微生物修復技術是一種原位生物修復技術，具有安全溫和、效率高、效果好、費用低、無二次污染等多個優點，適合大面積面源污染修復，是土壤有機污染物修復技術的主流和發展方向。而且抗/降解除草劑轉基因技術是解決除草劑藥害的有效途徑，而抗除草劑和降解除草劑的基因一般來自微生物降解基因。

麥草畏(dicamba)(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸，又名百草敵)是60年代由諾華(現在的先正達)開發的激素類除草劑，對一年生和多年生闊葉雜草有顯著防除效果。麥草畏用于苗后噴霧，藥劑被被植株吸收、傳導，多集中在分生組織及代謝活動旺盛的部位，阻礙植物激素的正常活動，從而使其死亡，能防除200多種雜草，廣泛應用于玉米、高粱和小麥等農田雜草防治，目前全球使用量達1.5萬噸。麥草畏具有廣譜高效、低毒和雜草抗性產生慢等優點，可有效殺死草甘膦抗性雜草，是美國孟山都生物技術公司研發的新一代抗除草劑轉基因作物的靶標除草劑。孟山都公司利用麥草畏脫甲基酶基因dmo構建了抗除草劑轉基因大豆和棉花，2015年進入商業化階段，可以預見，隨著抗麥草畏轉基因作物的商業化推廣，麥草畏的使用量會大幅度提高。麥草畏在土壤中穩定，一般能保持40天以上，其在環境中的降解的主力軍是微生物，目前已篩選到多種麥草畏的降解菌株，克隆到多個麥草畏降解基因，但是關于麥草畏的微生物降解中間產物3,6-二氯龍膽酸的進一步降解機制，降解基因和酶，目前還沒有報道，這嚴重制約了對麥草畏的環境行為和生態安全方面的研究。因此有必要深入研究麥草畏的微生物代謝的完整降解途徑，降解機制，這對研究麥草畏在環境遷移、轉化和降解等環境行為及生態安全性具有重要的指導價值。

3,6-二氯龍膽酸(3,6-DCGA)是麥草畏微生物代謝過程中的中間產物，是氯代芳香化合物，脫氯反應一般為脫毒反應，因此3,6-二氯龍膽酸脫氯酶基因和酶的鑒定具有非常重要的應用價值。在治理農藥殘留中主要具有以下作用，(一)通過現代生物工程技術將降解基因導入作物構建相應的除草劑抗性轉基因作物，(二)通過現代微生物發酵技術將脫氯酶DsmH1和DsmH2制成酶制劑，實現土壤原位修復。綜上所述，開展麥草畏降解過程中的降解基因、酶的研究具有非常重要的理論和實際應用價值。

發明內容

本發明的目的是針對現有麥草畏微生物降解機制研究的缺乏，提供3,6-二氯龍膽酸脫氯酶基因，該基因參與麥草畏下游降解路徑，麥草畏脫甲基生成3,6-二氯水楊酸(3,6-DCSA)，然后3,6-DCSA 5-羥基化生成3,6-二氯龍膽酸(3,6-DCGA)，本發明脫氯酶DsmH2能將3,6-二氯龍膽酸6號位置的氯離子脫去生成3-氯龍膽酸，代謝途徑見圖1。本發明的另一目的是提供該3,6-二氯龍膽酸脫氯酶基因編碼的蛋白DsmH2。DsmH2是首次發現參與麥草畏下游代謝路徑的依賴GSH的谷胱甘肽硫轉移酶類型的還原脫氯酶。本發明的又一目的是提供基因dsmH2及其編碼蛋白的應用。

發明內容

本發明的目的可通過以下技術方案實現：