[發明專利]一種針對于雌性基因編輯的方法

有效

• 申請號: 201810237058.6
• 申請日: 2018-03-21
• 公開（公告）號: CN108504691B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 陳子江;吳克良;趙涵;馬金龍
• 申請（專利權）人: 陳子江;山東山大附屬生殖醫院有限公司
• 主分類號: C12N15/873
• 分類號: C12N15/873;C12N15/90
• 代理公司: 北京邦信陽專利商標代理有限公司 11012
• 代理人: 陳悅軍

本發明公開了一種針對于雌性基因的編輯方法，包括以下步驟：孤雌受精卵的獲得、孤雌受精卵基因編輯、編輯后孤雌胚胎卵裂球的分離、重構孤雌胚胎、編輯結果的鑒定。本發明的方法能夠間接的實現對哺乳動物卵子進行精準編輯的功能，并且能夠確保最終基因編輯的效果，利于基因編輯技術向臨床醫學的轉化。

技術領域

本發明涉及一種雌性基因的編輯方法，更具體地，涉及一種基因編輯技術結合細胞核移植技術進行雌性基因編輯的方法。

背景技術

基因編輯技術目前在研究領域獲得了越來越多的進展，并在人類的細胞樣本中進行了大規模的嘗試。但目前基因編輯技術的主要風險仍然是編輯效率以及脫靶問題，這對于臨床的推廣使用尤為關鍵，只有克服了相關的風險，才能安全的向臨床進行推廣。目前針對于胚胎基因編輯，在不對胚胎的所有細胞進行檢測之前我們無法明確編輯的效率，故檢測之前我們無法預判哪個細胞是成功編輯的，哪個細胞是編輯失敗的。但一旦經過分子檢測，則該細胞將失去利用價值，這對于胚胎本身來說是致命的。另外一方面，在現有的技術條件下，無法對哺乳動物的雌性染色體進行相關的基因編輯，這進一步限制了基因編輯技術將來的應用范圍。

發明內容

為了有效的對雌性基因進行100％成功編輯，本發明提供了一種基因編輯技術聯合核移植技術的基因編輯方法，能夠實現對雌性基因編輯效果確認后并加以利用。

為了解決以上技術問題，本發明提供一種針對于雌性基因的編輯方法，包括以下步驟：

1)孤雌受精卵的獲得：制備僅含有單倍孤雌染色體的孤雌受精卵；

2)孤雌受精卵基因編輯：在原核期利用基因編輯技術對所述孤雌受精卵的目的基因進行編輯；

3)編輯后孤雌胚胎卵裂球的分離：將步驟2)編輯后的孤雌受精卵進行胚胎培養至具有卵裂球的時期，分離出其中一個卵裂球；

4)重構孤雌胚胎：將步驟3)分離出來的卵裂球與MII期卵母細胞進行重構，得到重構孤雌受精卵，將所述重構孤雌受精卵繼續進行胚胎培養至具有卵裂球的時期；

5)編輯結果的鑒定：取出步驟4)培養得到的一個卵裂球進行編輯結果的鑒定，步驟4)得到的剩余卵裂球的基因組與用于鑒定的卵裂球的基因組完全一致；

所述方法用到的所有細胞和染色體均來源于非人類哺乳動物。

上述方法中，步驟1)中制備所述孤雌受精卵的方法包括以下a或b所述的步驟：

a.將單精子注射到MII期卵母細胞使其激活受精，在原核期去除雄原核保留雌原核；

b.將MII期卵母細胞進行孤雌激活。

上述方法中，步驟b中所述激活的方法為化學激活、電激活，優選為鈣離子載體A23187聯合嘌呤霉素的化學激活方式激活。

上述方法中，步驟2)中所述基因編輯技術為鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effectornuclease,TALEN)或CRISPR/Cas9技術；

所述編輯的方式為對所述目的基因進行堿基修飾、堿基插入、堿基敲除和堿基替換中的一種或多種。

上述任一所述的方法中，步驟3)和步驟4)中所述具有卵裂球的時期為2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、32細胞期、融合胚期、桑葚胚期或囊胚期。

上述任一所述的方法中，步驟4)中所述重構的方式為電融合、病毒融合和細胞注射中的一種或多種。

上述任一所述的方法中，步驟4)中所述重構孤雌受精卵的方法包括以下i-iii任一項所述的步驟：