[發明專利]一種檢測樹鼩腺病毒的實時熒光定量PCR引物、探針和試劑盒

有效

• 申請號: 201810231031.6
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN108315480B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 孫曉梅;宋慶凱;李曉飛;代解杰;罕園園
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司 53100
• 代理人: 陳左;于洪

本發明涉及一種檢測樹鼩腺病毒的實時熒光定量PCR引物、探針和試劑盒，屬于生物技術領域。該引物是根據本實驗室分離鑒定并測序的樹鼩全基因組3′端保守序列設計合成，與樹鼩源及其他物種常見病毒無交叉反應，探針5’端連接有熒光報告基團，3’端連接有熒光淬滅基團。通過本發明試劑盒檢測，所得結果更加準確、可靠、穩定性好、重復性好。靈敏度高、定量快速準確、檢測范圍廣。也可以應用于樹鼩腺病毒引起的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種檢測樹鼩腺病毒的實時熒光定量PCR引物、探針和試劑盒，更具體涉及一種檢測樹鼩腺病毒的TaqMan實時熒光定量PCR引物和探針，同時還涉及樹鼩腺病毒的TaqMan實時熒光定量PCR 檢測試劑盒，該TaqMan實時熒光定量PCR試劑盒可高效方便的對各種生物材料的樹鼩源腺病毒進行定量檢測和質量監控，也可以進行樹鼩腺病毒的流行病學調查，還可以為相關基礎研究提供技術支持，應用前景十分廣泛。

背景技術

樹鼩腺病毒 (Tree Shrew Adenovirus，TAV)屬于腺病毒科，哺乳動物腺病毒屬。腺病毒無囊膜，病毒粒子為二十面體，直徑為80～110nm，由252個殼粒組成。一般感染哺乳動物的腺病毒相對分子質量為20～25×10⁶，G+C含量為48%～61%。迄今，已發現有100多種腺病毒能感染人、哺乳動物和禽類。腺病毒分布十分廣泛，一般對于人體沒有致癌性，但是腺病毒感染會引起急性上呼吸道感染、急性眼結膜炎、急性出血性膀胱炎、腹瀉等疾病。前期開展的相關研究表明，野生來源樹鼩中腺病毒攜帶率較高，并有疑似病例發生，被列為樹鼩實驗動物微生物質量控制的檢測指標之一。因此，建立一種高效、快速，可反應個體病毒載量的實時熒光定量PCR方法勢在必行。

目前檢測技術一般來說有血清學診斷技術、生物學試驗、分子生物學診斷技術三類：a）血清學診斷技術包括免疫熒光技術（IFA）、雙抗體夾心ELISA檢測等。但由于所有實驗均用到抗血清和抗原免疫反應，所以反應時間長、材料多、準備周期長，而且檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復性差。b)生物學試驗包括動物實驗和細胞培養。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品存在抗補體活性，影響檢測效果。動物實驗成本較高、檢測周期長，耗費大量生物資源和人力物力。c)分子生物學診斷技術，即應用PCR技術檢測樹鼩腺病毒持續感染。相比之下，PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。但普通的PCR檢測方法測定的都是PCR的終產物，而不是起始的DNA或RNA拷貝數。由于PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以無法定量起始的DNA或RNA拷貝數。

近年發展起來的實時熒光定量PCR技術(Real-time fluorescence quantitativePCR)有靈敏度高、速度快、特異性好等優點。目前使用比較多的是SYBR Green I熒光染料法和Taqman法。兩種方法都具有靈敏度高、檢測速度快、特異性好的優點。在基因表達水平分析、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應用，并且已成為當前病毒核酸定量的主要方法。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種檢測樹鼩腺病毒的實時熒光定量PCR引物、探針及方法和試劑盒，該方法簡單方便、靈敏度高且檢測時間短，同時，本發明試劑盒適用于目前市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，結果更加準確、可靠、穩定性好、重復性好。靈敏度高、定量快速準確、檢測范圍廣。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種檢測樹鼩腺病毒的實時熒光定量PCR引物，核苷酸序列為：

上游引物：5′-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3′，

下游引物：5′-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3′。

本發明還提供與所述引物配合使用的探針，核苷酸序列為：