[發明專利]一種雙CAR-T細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201810228590.1
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN108220247A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 屈彩云
• 申請（專利權）人: 杭州史迪姆生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 杭州華知專利事務所(普通合伙) 33235
• 代理人: 趙梅

本發明公開了一種雙CAR?T細胞，利用在腫瘤細胞中共表達，但在正常細胞中不共表達的兩個靶標抗原，其中一個靶標抗原的抗體可變區與T細胞中殺傷信號融合，另一個靶標抗原的抗體可變區與T細胞中共刺激信號融合，形成兩個不同的表達盒，構建所述雙CAR?T細胞；構建的雙CAR?T細胞只識別同時表達兩個靶標抗原的腫瘤細胞，而不識別僅表達其中一個靶標抗原的正常細胞。本發明還公開了其制備方法和應用。本發明不僅提高了殺傷特異性，而且減少對正常細胞的殺傷與降低了炎癥因子風暴帶來的副作用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種雙CAR-T細胞及其制備方法和應用。

背景技術

白血病是一種造血干細胞惡性增殖性血液疾病。正常情況下骨髓產生的白細胞幫助人體抵抗感染，而在白血病人骨髓產生不正常的白血球細胞，這些惡性白血球細胞大量擴增排斥體內存在的正常血液細胞，引起血液中免疫細胞失衡，影響機體血液細胞正常功能。白血病包括急性髓性白血病，慢性淋巴細胞白血病，霍奇金氏白血病，非霍奇金氏白血病等。慢性淋巴細胞白血病通常發生在中老年人群中，青少年人群中很少發生。目前治療白血病的方法主要有化療、放療、免疫治療。化療與放療不能有效清除惡性白血球細胞，因其副作用也給患者帶來巨大痛苦。以CD19為主要免疫抗原的靶向特異性免疫治療方法(CAR-T－CD19)在臨床表現出較好的治療效果，能有效清除白血病細胞。但CAR-T－CD19將共刺激信號與殺傷信號融合到一起，通過CD19抗體識別白血病細胞，這種設計方式能有效激活T細胞直接殺傷腫瘤靶細胞，但是正常組織中也含有CD19抗原，因此，CAR-T－CD19也會攻擊殺傷表達這些抗原的正常組織，產生嚴重的副作用。臨床實驗中出現較高的死亡率而多被叫停。同時，腫瘤復雜的多樣性也會引起抗原丟失，使得CAR-T細胞產生脫靶效應。除此之外，這種將共刺激信號與殺傷信號融合迅速激活T細胞的殺傷方式因其強烈的對腫瘤細胞與正常組織細胞的殺傷效應，引起一系列免疫反應產生炎癥因子風暴，對病人身體產生巨大傷害，也嚴重影響了免疫治療效果。

發明內容

本發明的目的是提供一種雙CAR-T細胞及其制備方法和應用，以解決CAR-T技術中毒性作用過高的問題。因為在腫瘤中，幾乎不可能找到一個靶位完全只在腫瘤細胞中表達，不在正常組織中表達，所以，任何單一的靶標治療方案均無法解決在攻擊腫瘤細胞的同時，不攻擊正常組織，即臨床中的毒副作用問題。但是，利用兩個在腫瘤組織中高表達的靶標，只有這兩個靶標同時高表達時才會激活CAR-T并對腫瘤細胞進行殺傷，而這兩個靶標幾乎不在正常組織中同時表達，因此，CAR-T就不會攻擊正常組織，從而降低毒副作用。

本發明采用以下技術方案：

一種雙CAR-T細胞，利用在腫瘤細胞中共表達，但在正常細胞中不共表達的兩個靶標抗原，其中一個靶標抗原的抗體可變區與T細胞中殺傷信號融合，另一個靶標抗原的抗體可變區與T細胞中共刺激信號融合，形成兩個不同的表達盒，構建所述雙CAR-T細胞；構建的雙CAR-T細胞只識別同時表達兩個靶標抗原的腫瘤細胞，而不識別僅表達其中一個靶標抗原的正常細胞。

進一步地，所述兩個靶標抗原中一個靶標抗原為CDX，X為19；另一個靶標抗原為CDY，Y為160、123或23。

進一步地，所述T細胞中殺傷信號包括CD3zeta。

進一步地，所述T細胞中共刺激信號包括CD28、4-1BB、OX40。

上述雙CAR-T細胞的制備方法，包括如下步驟：

步驟1、構建表達CDY/XCAR慢病毒載體；

步驟2、慢病毒包裝：得到表達CDY/XCAR慢病毒；

步驟3、慢病毒感染T細胞：分離人外周血單核細胞，培養和擴增T細胞，利用步驟2得到的表達CDY/XCAR慢病毒感染T細胞，得到表達CDY/XCAR的T細胞：CDY/XCAR-T，即雙CAR-T細胞。