[發明專利]一種糞便基因標志物的篩選及應用

有效

• 申請號: 201810227886.1
• 申請日: 2018-03-20
• 公開（公告）號: CN109658980B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 肖勤;錢逸維;陳生弟;楊曉東;徐紹卿
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院
• 主分類號: G16B20/20
• 分類號: G16B20/20;G16B40/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及到一種基于高通量宏基因組學測序分析的糞便基因標志物的篩選及應用。本發明通過提取糞便DNA使用鳥槍法進行宏基因組學測序和ROC曲線分析，篩選出基因標志物，并通過熒光實時定量PCR驗證基因標志物獲得其一致性。本發明首次在中國PD患者糞便中進行宏基因組高通量鳥槍測序技術測定，建立糞便基因標志物的篩選方法，發現PD患者糞便中眾多差異基因，從中篩選出25個糞便基因標志物，可作為PD診斷標志物，用于PD患者的輔助診斷，對于豐富和深入了解PD的病理機制等，具有重要的學術意義和應用前景。

技術領域

本發明涉及生物醫學領域，尤其涉及到一種基于高通量宏基因組學測序分析的糞便基因標志物的篩選及應用。

背景技術

帕金森病(Parkinson's?disease,PD)是中老年人常見的一種緩慢進展的神經系統變性疾病，嚴重影響患者的生活質量。主要臨床特征為運動癥狀，包括靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢步態異常等。隨著我國人口老齡化進程的加快，PD發病率日益增高，發病人數逐年增加，目前我國的PD病患者已超過200萬。PD的主要病理變化為α-突觸核蛋白(a-synuclein,a-syn)的異常聚集導致中腦黑質致密部多巴胺能神經元的選擇性丟失和殘存神經元胞漿內路易小體的形成。當PD病患者出現典型的運動癥狀，此時中腦黑質多巴胺能神經元已存在嚴重丟失，所以PD早期診斷、早期干預顯得尤為重要。目前PD的診斷主要基于患者的臨床表現及醫生的臨床經驗，這就導致了不少PD患者被漏診或誤診。因此，一方面亟需找到靈敏可靠的生物學標志物，另一方面需要操作簡便、經濟的輔助檢查手段為PD診斷提供幫助。

目前已有的關于PD生物學標志物研究主要集中在臨床癥狀、神經影像和生物化學幾方面：

1、PD臨床癥狀：運動癥狀是目前PD診斷的主要依據，然而運動遲緩、肌強直和靜止性震顫這些典型的運動癥狀只有在多巴胺能神經元大量缺失時才出現，不能作為早期診斷的標記物。非運動癥狀如嗅覺減退、快動眼睡眠行為障礙以及便秘的發生可遠早于運動癥狀，但對PD診斷的敏感度和特異度不高。

2、神經影像：目前已知的PD診斷的影像學方法有正電子發射計算機斷層顯像(positron?emission?tomography，PET)、單光子發射計算機斷層成像術(single-photonemissioncomputed?tomography，SPECT)，磁共振成像(magnetic?resonance?imaging，MRI)等，均因價格昂貴、實踐性不強或特異性差難以推廣。

3、生物化學：關于PD早期診斷的生物化學標志物研究涉及免疫、炎癥、氧化應激、細胞凋亡等多個領域，其中以α-syn最具研究前景。Borghi等首次在腦脊液中檢測到α-syn后，有關該項生物學標志物的研究備受關注。然而，PD患者腦脊液α-syn表達水平的變化存有較大爭議。由于腦脊液檢測在臨床應用中的限制，一些研究者開始關注外周血及唾液α-syn表達變化。但是到目前為止，來自血液和唾液樣本的研究結果并不完全相同。

因此，至今尚未發現一個敏感度和特異性高，可在臨床廣泛應用的PD診斷的生物學標記物。

發明內容

本發明的目的是提供一種糞便基因標志物的篩選及應用。本發明目的尋找一個敏感度和特異性高可供PD診斷的生物學標記物。

本發明為解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種糞便基因標志物的篩選方法，包括如下步驟：

(1)收集帕金森病患者與其健康配偶的糞便，于-20～-80℃下保存；

(2)提取(1)中糞便基因DNA；

(3)鳥槍法測序后進行生物信息分析，建立參考基因集，從帕金森病患者和健康配偶的差異基因中篩出目的基因序列用作基因標志物,進行受試者工作特征(receiveroperating?characteristic,ROC)曲線分析，明確其疾病區分能力，具體方法包括如下：