[發(fā)明專利]一種組合型配基、組合型仿生層析介質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810225371.8
• 申請(qǐng)日: 2018-03-19
• 公開（公告）號(hào): CN108558988B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姚善涇;林東強(qiáng);張其磊;鄒徐俊;盧慧麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K5/087
• 分類號(hào): C07K5/087;C07K16/00;C07K1/22;B01D15/08
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 陳華

本發(fā)明涉及一種組合型配基、組合型仿生層析介質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用，其中組合型仿生層析介質(zhì)以親水性多孔微球?yàn)閷游龌|(zhì)，采用烯丙基溴活化，N?溴代丁二酰亞胺溴代醇化，然后偶聯(lián)組合型配基。組合型配基的序列為苯丙氨酸?酪氨酸?谷氨酸?5?氨基苯并咪唑。該組合型仿生層析介質(zhì)同時(shí)具有苯丙氨酸?酪氨酸?谷氨酸三肽和氨基苯并咪唑兩種功能基團(tuán)，在保留多肽配基對(duì)抗體選擇性高的特點(diǎn)上，引入疏水電荷誘導(dǎo)配基，使得洗脫條件更加溫和，能實(shí)現(xiàn)有效地抗體分離。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及仿生層析領(lǐng)域，具體涉及一種組合型配基、組合型仿生層析介質(zhì)及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗體的靶向性強(qiáng)、生物相容性高，具有開發(fā)成治療癌癥等藥物的極大潛力。隨著抗體工程地不斷發(fā)展，上游抗體表達(dá)和制備規(guī)模不斷提高，開發(fā)高效的下游分離純化技術(shù)是抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。

目前蛋白A親和層析是最為常用的抗體捕獲方法，具有很高的選擇性，但是介質(zhì)價(jià)格昂貴，洗脫條件苛刻，且存在配基脫落的風(fēng)險(xiǎn)。因此，開發(fā)替代技術(shù)成為當(dāng)前的熱點(diǎn)，短肽仿生層析和疏水電荷誘導(dǎo)層析(Hydrophobic charge induction chromatography,HCIC)是其中重要的兩種。

短肽仿生層析是以短肽化合物作為配基的一種新型仿生親和層析方法，短肽配基基于目標(biāo)蛋白而設(shè)計(jì)，具有較高的選擇性、穩(wěn)定性和生物相容性好。美國(guó)專利(US7408030B2)公開了六肽配基HWRGWV，用于血清、腹水、細(xì)胞培養(yǎng)液和牛奶等料液中分離抗體。但是，配基中帶有電荷的精氨酸會(huì)對(duì)血清白蛋白產(chǎn)生吸附，降低配基的選擇性，只有在較高鹽濃度或者添加辛酸鈉時(shí)才能得到純度較高的IgG(J.Chromatogr.A,1218:1691-1700,2011)。隨著計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)的引入，加速了多肽配基的篩選和優(yōu)化設(shè)計(jì)。基于蛋白A親和模型，中國(guó)發(fā)明專利(CN 103014880A)公開了八肽配基FYWHCLDE，體現(xiàn)出良好的IgG分離性能。不過，相關(guān)機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)IgG結(jié)合主要依靠靜電相互作用，需要通過添加NaCl進(jìn)行洗脫(J.Chromatogr.A,1359:100-111,2014)。基于蛋白A的Fc片段結(jié)合位點(diǎn)的分子模擬，中國(guó)發(fā)明專利(CN 104645949 A)公開了四肽配基YFRH，具有較高的IgG吸附容量和耐鹽特性，洗脫條件溫和。但是，該配基中也存在帶電的精氨酸，在pH大于4的條件下對(duì)血清白蛋白的吸附量也較大，影響了介質(zhì)對(duì)IgG的選擇性(Biochem.Eng.J.,114:191–201,2016)。因此，多肽配基還需要進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)，既保持良好的IgG結(jié)合選擇性，又需要具有溫和的洗脫條件。

HCIC由Burton和Harding提出(J.Chromatogr.A,71:81,1998)，配基兼具疏水和離子化基團(tuán)，中性pH條件下通過疏水作用結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)溶液pH使得蛋白和配基間產(chǎn)生靜電排斥作用，從而實(shí)現(xiàn)洗脫。美國(guó)專利(US 5652348 B2,US 7144743B2)描述了HCIC介質(zhì)的制備方法，指出在低鹽和高鹽條件下均能實(shí)現(xiàn)蛋白的有效結(jié)合。已報(bào)道的HCIC配基包括吲哚化合物(CN 101036877 A)、咪唑化合物(CN 101185882 A)、咪唑和苯組成的化合物(CN101185881 A)等，具有較強(qiáng)的耐鹽吸附特性，洗脫條件也較溫和。中國(guó)發(fā)明專利(CN104096544 A)報(bào)道了一種用于抗體分離的HCIC介質(zhì)，以氨基苯并咪唑?yàn)楣δ芘浠?，具有較高的抗體結(jié)合能力和非鹽依賴吸附性能。但是，HCIC配基也存在一些缺陷，配基結(jié)構(gòu)較單一，對(duì)抗體的選擇性不高，對(duì)于不同來源的抗體，需要大量的過程優(yōu)化，從復(fù)雜料液中分離得到高純度的抗體較為困難。

綜上所述，短肽仿生層析和HCIC各有優(yōu)缺點(diǎn)。中國(guó)發(fā)明專利(CN 104117345 A)提出了色氨酸和氨基苯并咪唑組成的雙功能基團(tuán)介質(zhì)，在保留氨基苯并咪唑的HCIC特點(diǎn)的同時(shí)，引入色氨酸后，在一定程度上提高了對(duì)抗體的選擇性，不過效果比較有限，血清白蛋白仍會(huì)部分吸附(J.Chromatogr.A,258:264,2016)。

發(fā)明內(nèi)容