[發(fā)明專利]一種高密度培養(yǎng)原甲藻的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810224941.1
• 申請(qǐng)日: 2018-03-19
• 公開（公告）號(hào): CN108251308B
• 公開（公告）日: 2021-07-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊成奇;田曉清;喬玉寶;唐瑩瑩;陸亞男;馬麗艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12N1/12
• 分類號(hào): C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 上海順華專利代理有限責(zé)任公司 31203
• 代理人: 陸林輝

本發(fā)明公開了一種高密度培養(yǎng)原甲藻的方法，其包括步驟：(a)在無菌操作室，將原甲藻藻種液接種于裝有滅菌的f2培養(yǎng)基的10～50L夾套式玻璃反應(yīng)釜中，f2培養(yǎng)基的鹽度為20?28；(b)轉(zhuǎn)移至常規(guī)實(shí)驗(yàn)室，通入滅菌的空氣，控制光照度為3000?5000lux，光/暗周期14h/10h，夾套循環(huán)水溫度控制22?25℃，培養(yǎng)10～20天；(c)在無菌操作室，從反應(yīng)釜出料口放出大部分培養(yǎng)好的藻液，添加新鮮滅菌的f2培養(yǎng)基于反應(yīng)釜中，轉(zhuǎn)移至常規(guī)實(shí)驗(yàn)室以步驟b相同條件繼續(xù)下一個(gè)培養(yǎng)周期。本發(fā)明的整個(gè)培養(yǎng)過程操作簡便，培養(yǎng)體積小而細(xì)胞密度極高，能更高效獲得其總提取物；且對(duì)比大體積玻璃瓶或玻璃缸培養(yǎng)，不需要一直在無菌、恒溫的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，能耗低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬海洋微型單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是涉及一種高密度培養(yǎng)原甲藻的方法。

背景技術(shù)

海洋生物因富含結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次生代謝產(chǎn)物而成為當(dāng)今最具開發(fā)潛力的新藥來源，除了海綿、珊瑚、海鞘等海洋無脊椎動(dòng)物以及放線菌、真菌等海洋微生物之外，海洋微藻資源也是海洋天然藥物化學(xué)研究的熱點(diǎn)對(duì)象之一；其代謝產(chǎn)生的聚酮、聚醚、生物堿類成分，因其對(duì)哺乳動(dòng)物的特定毒理表現(xiàn)特征，被劃分為神經(jīng)性貝毒、麻痹性貝毒、腹瀉性貝毒、環(huán)亞胺毒素等8大類海洋生物毒素，其監(jiān)測是水產(chǎn)品質(zhì)量安全核心內(nèi)容。雖然強(qiáng)烈的毒性限制了海洋生物毒素中大部分化合物在藥物開發(fā)中的廣泛應(yīng)用，但由于作用靶點(diǎn)特殊、低濃度、高活性等藥理特征，經(jīng)常作為工具藥物，并有可能開發(fā)成為低劑量(低毒)、高效的特殊用途藥物；其中河鲀毒素(tetrodotoxin,TTX)成為毒素開發(fā)成新型藥物的典型例子。

原甲藻(Prorocentrum sp.)屬微藻代謝產(chǎn)生的多種骨架類型的聚酮類化合物、生物堿、甾醇等近60余種海洋天然產(chǎn)物，其中OA、DTX-1等34個(gè)聚酮類為典型的腹瀉性貝毒及其結(jié)構(gòu)類似物，而prorocentrolide、spiro-prorocentrimine等6個(gè)生物堿則屬于環(huán)亞胺類毒素成分，另有新穎的聚酮骨架的大環(huán)內(nèi)酯、鏈狀多烯/多羥基化合物；其中OA、DTX-1等是高選擇性的蛋白磷酸酶2A(PP2A)抑制劑。

由于在原甲藻或染毒貝類樣品中極微量，天然純化獲得的高純度OA商品價(jià)格極高，平均1000USD/mg，且主要依賴進(jìn)口，應(yīng)用于水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中的腹瀉性貝毒標(biāo)準(zhǔn)品。利用產(chǎn)毒的原甲藻Prorocentrum mexicanum PM03、Prorocentrum lima PL11等藻種資源，高密度培養(yǎng)、收集藻細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)可持續(xù)地產(chǎn)出OA等海洋生物毒素商品，具有較好的市場前景。

小體積海洋微藻培養(yǎng)常用光照培養(yǎng)箱靜置或通氣培養(yǎng)，大容量培養(yǎng)通常在專業(yè)的具有無菌、恒溫、光照條件的培養(yǎng)室內(nèi)用玻璃缸、玻璃管道培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱容量小、價(jià)格較高，步入式培養(yǎng)室則溫控系統(tǒng)能耗高，且要求操作人員無菌防護(hù)較為嚴(yán)格。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可用于規(guī)模化培養(yǎng)高密度原甲藻的方法，該方法操作簡便，可在減小培養(yǎng)體積的情況下達(dá)到收獲更多細(xì)胞的目標(biāo)，用常規(guī)的20L夾套式玻璃反應(yīng)釜培養(yǎng)原甲藻PM03、PL11的細(xì)胞密度高達(dá)2×10⁸cells/L，且對(duì)比大體積玻璃瓶或玻璃缸培養(yǎng)，不需要一直在無菌、恒溫的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，能耗低。過濾培養(yǎng)好的藻液，收集藻細(xì)胞-18℃冷凍保藏，可用于提取總毒素等代謝產(chǎn)物，水相通過大孔吸附樹脂回收胞外的毒素成分，能更高效獲得總提取物。

本發(fā)明的高密度培養(yǎng)原甲藻的方法包括步驟：

(a)在無菌操作室，將原甲藻藻種液按照5％-10％的體積比接種于裝有滅菌的f2培養(yǎng)基的10～50L夾套式玻璃反應(yīng)釜中，藻種液濃度為10⁶～10⁸cells/L，f2培養(yǎng)基的鹽度為20-28；

(b)轉(zhuǎn)移至常規(guī)實(shí)驗(yàn)室，通入滅菌的空氣，控制光照度為3000-5000lux，光/暗周期14h/10h，夾套循環(huán)水溫度控制22-25℃，培養(yǎng)10～20天至藻液細(xì)胞密度達(dá)到10⁷～10⁹cells/L；