[發(fā)明專利]T4DNA連接酶的活性檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810214423.1 | 申請日： | 2018-03-15 |
| 公開（公告）號： | CN109468364B | 公開（公告）日： | 2022-02-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 盛司潼;魯金輝;張慧慧;李喬喬 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢康昕瑞基因健康科技有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6834 | 分類號： | C12Q1/6834;C12Q1/25 |
| 代理公司： | 武漢藍寶石專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42242 | 代理人： | 劉楨 |
| 地址： | 430040 湖北省武漢市東湖新技術(shù)*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | t4dna 連接酶 活性 檢測 方法 | ||
本發(fā)明涉及一種T4 DNA連接酶的活性檢測方法，包括：提供一端與磁珠固定的第一DNA片段；提供第二DNA片段，所述第一DNA片段和第二DNA片段端部具有互補堿基序列；使用待測T4連接酶連接第二DNA片段和第一DNA片段；將連接有第一DNA片段和第二DNA片段的磁珠固定至玻片；使用第一探針對玻片上第一DNA片段進行標示并計數(shù)；使用第二探針對玻片上第二DNA片段進行標示并計數(shù)；定義第二DNA片段的數(shù)量和第一DNA片段的數(shù)量的比值作為待測T4連接酶活性參考值。本發(fā)明T4 DNA連接酶的活性檢測的結(jié)果較為準確。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及基因測序領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種T4 DNA連接酶的活性檢測方法。
背景技術(shù)
T4 DNA連接酶，可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結(jié)合，該催化反應(yīng)需ATP作為輔助因子。同時T4 DNA連接酶可以修補雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA/RNA雜合物上的單鏈缺口(single-strand nicks)。
近年來基因測序技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)成為了廣泛使用的生物醫(yī)學(xué)檢測手段。現(xiàn)有技術(shù)的基因測序在多個步驟中都會使用T4 DNA連接酶，例如待測序列和接頭之間的連接、測序探針和測序引物之間的固定，因此T4 DNA連接酶的活性是基因測序反應(yīng)能夠順利實現(xiàn)和穩(wěn)定進行的重要因素，現(xiàn)有技術(shù)對T4 DNA連接酶的活性可以通過利用線性熒光探針作為核酸連接反應(yīng)的模板和信號分子,通過實時監(jiān)測熒光信號的降低來表征連接產(chǎn)物的生成過程,從而進行連續(xù)、簡單且特異性高的T4 DNA連接酶活性分析檢測。由于熒光信號變化值無法具體量化，導(dǎo)致傳統(tǒng)的活性測定會產(chǎn)生較大的誤差，因此有必要提供一種比較準確的活性測定方法克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種準確的T4 DNA連接酶的活性檢測方法。
一種T4 DNA連接酶的活性檢測方法，包括：提供一端與磁珠固定的第一DNA片段；提供第二DNA片段，所述第一DNA片段和第二DNA片段端部具有互補堿基序列；使用待測T4連接酶連接第二DNA片段和第一DNA片段；將連接有第一DNA片段和第二DNA片段的磁珠固定至玻片；使用第一探針對玻片上第一DNA片段進行標示并計數(shù)；使用第二探針對玻片上第二DNA片段進行標示并計數(shù)；定義第二DNA片段的數(shù)量和第一DNA片段的數(shù)量的比值作為待測T4連接酶活性參考值。
進一步地，所述第一DNA片段為包括第一標簽序列的第一接頭。
進一步地，所述接頭的一端通過生物素與磁珠連接。
進一步地，所述第一探針為識別第一標簽序列的熒光探針，所述對玻片上第一DNA片段進行計數(shù)為拍攝第一探針連接第一DNA片段后的第一熒光圖并識別第一熒光圖中發(fā)光磁珠的數(shù)量作為第一DNA片段的數(shù)量。
進一步地，所述第二DNA片段為包括一突變位點的特異性擴增基因片段。
進一步地，所述第二探針為可識別突變位點所有堿基類型的熒光探針，對玻片上第二DNA片段進行計數(shù)為拍攝第二探針連接第二DNA片段后的第二熒光圖并識別第二熒光圖中發(fā)光磁珠的數(shù)量作為第二DNA片段的數(shù)量。
進一步地，所述第二DNA片段為包括第二標簽序列的第二接頭。
進一步地，所述第二探針為可識第二標簽序列的熒光探針，對玻片上第二DNA片段進行計數(shù)為拍攝第二探針連接第二DNA片段后的第二熒光圖并識別第二熒光圖中發(fā)光磁珠的數(shù)量作為第二DNA片段的數(shù)量。
進一步地，所述第二熒光圖中發(fā)光磁珠和第一熒光圖中發(fā)光磁珠位置相同的部分定義為第二DNA片段的數(shù)量。
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