[發(fā)明專利]一種傳染性脾腎壞死病毒ORF069基因缺失株及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810210972.1
• 申請(qǐng)日: 2018-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN108384764B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何建國;郭長軍;曾若云;林易凡;翁少萍;何鍵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/01;C12N15/85;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

本發(fā)明提供了一種傳染性脾腎壞死病毒ORF069基因缺失株及其制備方法和應(yīng)用，為傳染性脾腎壞死病毒株缺失ORF069基因后制成的減毒病毒株。本發(fā)明還提供了一種帶篩選標(biāo)記的傳染性脾腎壞死病毒ORF069基因缺失株及其制備方法和應(yīng)用，為傳染性脾腎壞死病毒缺失了ORF069基因，且在基因缺失的部位通過同源重組插入篩選標(biāo)記基因后制成的減毒病毒株。本發(fā)明提供的傳染性脾腎壞死病毒ORF069基因缺失株是一種敲除了ORF069基因的重組基因工程疫苗，毒力較弱，大大降低被免疫的魚類發(fā)病致死率，采用浸泡免疫即可達(dá)到顯著的免疫效果，無須注射，應(yīng)用價(jià)值極大。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防控領(lǐng)域，具體涉及一種傳染性脾腎壞死病毒ORF069基因缺失株及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

鱖，又名桂花魚，因其生長快、品質(zhì)優(yōu)良和味道鮮美等優(yōu)點(diǎn)成為我國主要淡水名特優(yōu)養(yǎng)殖魚類之一。由傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosisvirus, ISKNV)引起的鱖虹彩病毒病是鱖養(yǎng)殖的主要疫病, 導(dǎo)致鱖死亡率接近100%, 成為制約鱖養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要瓶頸。

傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）是腫大病毒屬的代表種，其全基因的組核酸序列已經(jīng)測定，全長為111362bp，G+C含量在54.78%，包含124個(gè)潛在的開放閱讀框（ORF），編碼長度從40到1208個(gè)氨基酸。通過序列分析，目前推測出ORF006L為主衣殼蛋白；ORF19R、ORF46L、ORF27L和ORF63L與DNA復(fù)制、修飾和加工有關(guān)；ORF24、ORF28L、ORF34R、ORF64L及ORF87R與轉(zhuǎn)錄和核苷酸代謝有關(guān)；ORF111L和ORF048R與宿主相互作用有關(guān)；ORF12、ORF65、ORF66、ORF99和ORF111L編碼環(huán)指蛋白。

接種疫苗是控制傳染性脾腎壞死病毒的主要手段，目前用于預(yù)防控制傳染性脾腎壞死病毒的ISKNV疫苗主要為細(xì)胞滅活疫苗，細(xì)胞滅活疫苗具有安全性好、免疫原性強(qiáng)、保護(hù)率高、研發(fā)周期短等優(yōu)點(diǎn)，成為最常用的疫苗種類，但滅活疫苗只能引起體液免疫，免疫應(yīng)答類型較單一，免疫維持時(shí)間較短，需要多次接種且接種量大等缺點(diǎn)。現(xiàn)在許多文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了基因缺失減毒活疫苗可以有效、安全地起到保護(hù)的效果，減毒活疫苗可誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫應(yīng)答類型較全面，免疫維持時(shí)間較長，接種次數(shù)少且接種量小等優(yōu)點(diǎn)成為目前ISKNV疫苗的研究新熱點(diǎn)。而以ISKNV ORF069基因缺失株作為基因缺失減毒活疫苗的研究未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供一種免疫效果好、使用便捷、應(yīng)用性強(qiáng)、無須注射的傳染性脾腎壞死病毒疫苗及其制備方法和應(yīng)用。在野生性傳染性脾腎壞死病毒的基因組中敲除了ORF069基因，構(gòu)建了ORF069基因缺失病毒（ISKNV△ORF069）。相比傳統(tǒng)疫苗的免疫方式，浸泡免疫是基因缺失疫苗的最大優(yōu)勢，這是魚類病毒性疫苗免疫方式的重大創(chuàng)新，具有廣闊的應(yīng)用空間。

本發(fā)明第一方面提供了一種傳染性脾腎壞死病毒ORF069基因缺失株，為傳染性脾腎壞死病毒株缺失ORF069基因后制成的減毒病毒株。

優(yōu)選地，所述ORF069基因序列為與SEQ ID NO：1所示序列具有至少 90％、至少95％、至少 98％、至少 99％或100%同源性的核苷酸序列。

第二方面，本發(fā)明提供了一種帶篩選標(biāo)記的傳染性脾腎壞死病毒ORF069基因缺失株，為傳染性脾腎壞死病毒缺失了ORF069基因，且在基因缺失的部位通過同源重組分別插入第一篩選基因和第二篩選基因后制成的減毒病毒株。

優(yōu)選地，所述ORF069基因序列為與SEQ ID NO.1所示序列具有至少 90％、至少95％、至少 98％、至少 99％或100%同源性的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述第一篩選基因和第二篩選基因不同，且分別獨(dú)立地選自插入紅色熒光蛋白基因以及抗性篩選基因。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述紅色熒光蛋白基因?yàn)镈sRed2蛋白基因。