[發(fā)明專利]一株氮哌酮單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810209891.X
• 申請(qǐng)日: 2018-03-14
• 公開（公告）號(hào): CN108410824B
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 匡華;林璐;胥傳來;徐麗廣;馬偉;劉麗強(qiáng);吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);無錫迪騰敏生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/20
• 分類號(hào): C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一株氮哌酮單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫檢測(cè)領(lǐng)域。本發(fā)明制備了氮哌酮完全抗原，并將它與等量弗氏佐劑混合乳化完全，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，得到一株產(chǎn)生氮哌酮抗體的雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No.14694。此細(xì)胞株分泌的單克隆抗體，對(duì)氮哌酮具有較好的特異性和檢測(cè)靈敏度(IC₅₀值為0.5ng/mL)。本發(fā)明成果可用于建立動(dòng)物性組織中氮哌酮?dú)埩舻拿庖邫z測(cè)方法，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株氮哌酮單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

氮哌酮(又稱阿扎哌隆，Azaperone，簡稱Azap)是一種丁酰苯類神經(jīng)安定藥。動(dòng)物經(jīng)肌肉注射此藥后可消除緊張感，活動(dòng)力下降，對(duì)環(huán)境淡漠并長期處于安靜狀態(tài)，有助于避免動(dòng)物因“聚居應(yīng)激”和在混群時(shí)發(fā)生互相攻擊和打斗的現(xiàn)象，降低因應(yīng)激及創(chuàng)傷引起的死亡率，因此在長途運(yùn)輸中常常給豬等動(dòng)物使用該藥。我國動(dòng)物性食品中最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定豬的肌肉、皮和脂肪、肝、腎中氮哌酮的最大殘留限量值(MRL)分別為60mg/kg，60mg/kg，100mg/kg，100mg/kg。因此，建立快速有效的檢測(cè)氮哌酮含量的方法具有重要意義及市場(chǎng)價(jià)值。

酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，然而得到高親和力和高特異性的單克隆抗體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。有關(guān)氮哌酮的殘留檢測(cè)方法報(bào)道文獻(xiàn)較少，因此建立快速簡便的氮哌酮檢測(cè)方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。建立高效的免疫學(xué)檢測(cè)方法，篩選高特異性的單克隆抗體是重要前提。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的首先是提供一株氮哌酮單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，已于2017年9月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.14694，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。由該細(xì)胞株制備的抗體對(duì)氮哌酮具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可以用來建立氮哌酮的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種氮哌酮單克隆抗體，它由所述保藏編號(hào)為CGMCC No.14694的氮哌酮單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。

所述氮哌酮單克隆抗體的應(yīng)用，用于動(dòng)物性組織中氮哌酮?dú)埩舻姆治鰴z測(cè)。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供制備所述氮哌酮免疫原的方法，主要包括以下步驟：

1)合成半抗原Azap：將4-苯丁酸甲酯，4-氯丁酰氯，和氯化鋁，加入二硫化碳中，升溫至室溫并攪拌過夜；向反應(yīng)液中加冰水，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，濃縮得黃色油狀中間產(chǎn)物2；

將中間產(chǎn)物2，碘化鉀，碳酸鉀，加入乙腈溶液中，加入1-(2-吡啶基)哌嗪，反應(yīng)液升溫至70℃過夜；向反應(yīng)液中加冰水，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，濃縮；經(jīng)硅膠柱純化得到黃色油狀中間產(chǎn)物3；

將中間產(chǎn)物3，氫氧化鋰，加入四氫呋喃和水；反應(yīng)液升溫至室溫，攪拌過夜；用鹽酸酸化至pH為6，飽和食鹽水水洗一次，無水硫酸鈉干燥，濃縮得白色固體，制備得半抗原Azap；

2)完全抗原的制備：

免疫原Azap-KLH的制備：稱取半抗原Azap，1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，以及N-羥基琥珀酰亞胺，用無水N,N-二甲基甲酰胺溶解得到A液；取鑰孔血藍(lán)蛋白KLH，用硼酸緩沖溶液溶解得到B液，在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，即得偶聯(lián)物Azap-KLH混合液，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原得到免疫原Azap-KLH。

本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供制備所述氮哌酮單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的方法，主要包括以下步驟：