[發明專利]一種傳染性脾腎壞死病毒ORF074基因缺失株及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201810209600.7
• 申請日: 2018-03-14
• 公開（公告）號: CN108384763B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 郭長軍;何建國;曾若云;林易凡;翁少萍;何鍵
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N7/01;C12N15/85;A61K39/12;A61P31/20;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 張小黎

本發明提供了一種傳染性脾腎壞死病毒ORF074基因缺失株及其制備方法和應用，為傳染性脾腎壞死病毒株缺失ORF074基因后制成的減毒病毒株。本發明還提供了一種帶篩選標記的傳染性脾腎壞死病毒ORF074基因缺失株及其制備方法和應用，為傳染性脾腎壞死病毒缺失了ORF074基因，且在基因缺失的部位通過同源重組插入篩選標記基因后制成的減毒病毒株。本發明提供的傳染性脾腎壞死病毒ORF074基因缺失株是一種敲除了ORF074基因的重組基因工程疫苗，毒力較弱，大大降低被免疫的魚類發病致死率，采用浸泡免疫即可達到顯著的免疫效果，無須注射，應用價值極大。

技術領域

本發明涉及水產養殖疾病防控領域，具體涉及一種傳染性脾腎壞死病毒ORF074基因缺失株及其制備方法和應用。

背景技術

鱖，又名桂花魚，因其生長快、品質優良和味道鮮美等優點成為我國主要淡水名特優養殖魚類之一。由傳染性脾腎壞死病毒(infectious spleen and kidney necrosisvirus, ISKNV)引起的鱖虹彩病毒病是鱖養殖的主要疫病, 導致鱖死亡率接近100%, 成為制約鱖養殖業發展的主要瓶頸。

傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）是腫大病毒屬的代表種，其全基因的組核酸序列已經測定，全長為111362bp，G+C含量在54.78%，包含124個潛在的開放閱讀框（ORF），編碼長度從40到1208個氨基酸。通過序列分析，目前推測出ORF006L為主衣殼蛋白；ORF19R、ORF46L、ORF27L和ORF63L與DNA復制、修飾和加工有關；ORF24、ORF28L、ORF34R、ORF64L及ORF87R與轉錄和核苷酸代謝有關；ORF111L和ORF048R與宿主相互作用有關；ORF12、ORF65、ORF66、ORF99和ORF111L編碼環指蛋白。

目前用于預防控制傳染性脾腎壞死病毒的ISKNV疫苗主要為細胞滅活疫苗，細胞滅活疫苗具有安全性好、免疫原性強、保護率高、研發周期短等優點，成為最常用的疫苗種類，但滅活疫苗只能引起體液免疫，免疫應答類型較單一，免疫維持時間較短，需要多次接種且接種量大等缺點。現在許多文獻已經報道了基因缺失減毒活疫苗可以有效、安全地起到保護的效果，減毒活疫苗可誘發體液免疫和細胞免疫，免疫應答類型較全面，免疫維持時間較長，接種次數少且接種量小等優點成為目前ISKNV疫苗的研究新熱點。而以ISKNVORF074基因缺失株作為基因缺失減毒活疫苗的研究未有報道。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種免疫效果好、使用便捷、應用性強、無須注射的傳染性脾腎壞死病毒疫苗及其制備方法和應用。在野生性傳染性脾腎壞死病毒的基因組中敲除了ORF074基因，構建了ORF074基因缺失病毒（ISKNV△ORF074）。相比傳統疫苗的免疫方式，浸泡免疫是基因缺失疫苗的最大優勢，這是魚類病毒性疫苗免疫方式的重大創新，具有廣闊的應用空間。

本發明第一方面提供了一種傳染性脾腎壞死病毒ORF074基因缺失株，為傳染性脾腎壞死病毒株缺失ORF074基因后制成的減毒病毒株。

優選地，所述ORF074基因序列為與SEQ ID NO：1所示序列具有至少 90％、至少95％、至少 98％、至少 99％或100%同源性的核苷酸序列。

第二方面，本發明提供了一種帶篩選標記的傳染性脾腎壞死病毒ORF074基因缺失株，為傳染性脾腎壞死病毒缺失了ORF074基因，且在基因缺失的部位通過同源重組分別插入第一篩選基因和第二篩選基因后制成的減毒病毒株。

優選地，所述ORF074基因序列為與SEQ ID NO.1所示序列具有至少 90％、至少95％、至少 98％、至少 99％或100%同源性的核苷酸序列。

優選地，所述第一篩選基因和第二篩選基因不同，且分別獨立地選自插入紅色熒光蛋白基因以及抗性篩選基因。

進一步優選地，所述紅色熒光蛋白基因為DsRed2蛋白基因。