[發(fā)明專利]重組溶瘤腺病毒、用于制備該重組溶瘤腺病毒的重組溶瘤腺病毒載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810206375.1
• 申請日: 2018-03-13
• 公開（公告）號: CN108424932B
• 公開（公告）日: 2021-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孟二紅
• 申請（專利權(quán)）人: 北京多贏時代轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;C12N7/01;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/04
• 代理公司: 北京中譽(yù)威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279
• 代理人: 周勇;周際

1.一種構(gòu)建以腫瘤干細(xì)胞和普通腫瘤細(xì)胞為雙重靶向性的重組溶瘤腺病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

在腺病毒質(zhì)粒AdEAsy-1纖維基因中HI loop的456T與457P之間引入編碼RGD-4C肽的基因，構(gòu)成靶向性骨架質(zhì)粒；

將shRNA抗腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子ALDH1A1的基因序列以及促凋亡基因PUMA的基因序列連接至第一穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV，構(gòu)成第二穿梭質(zhì)粒；

所述第一穿梭質(zhì)粒采用由CMVp連接促凋亡基因PUMA-Alpha的CDS區(qū)，再連接shRNA抗ALDH1A1的基因序列，所述促凋亡基因PUMA-Alpha在NCBI上的登記號為NM_014417；

將包含人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的溶瘤原件TERTp-E1A-E1B55K自質(zhì)粒pTE-D19K中切下，連接在第二穿梭質(zhì)粒pA信號序列的下游，即將人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子連接至第二穿梭質(zhì)粒，構(gòu)成第三穿梭質(zhì)粒；

將第三穿梭質(zhì)粒與靶向性骨架質(zhì)粒在大腸桿菌中重組為重組溶瘤腺病毒載體；

將所述的重組溶瘤腺病毒載體線性化后轉(zhuǎn)染至病毒包裝細(xì)胞中進(jìn)行包裝、擴(kuò)增、純化后獲得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述重組溶瘤腺病毒載體同時攜帶人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子、shRNA抗腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子ALDH1A1的基因序列、促凋亡基因PUMA的基因序列和編碼RGD肽的基因序列，其中所述人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述shRNA抗腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志分子ALDH1A1的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述促凋亡基因PUMA的基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述編碼RGD肽的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述病毒包裝細(xì)胞為人胚腎293細(xì)胞。

4.由權(quán)利要求1-3任一項所述方法構(gòu)建得到的重組溶瘤腺病毒。

5.權(quán)利要求4所述的重組溶瘤腺病毒在制備治療惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用。