[發(fā)明專利]一種蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改造的方法及其在普魯蘭酶中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810204136.2
• 申請日: 2018-03-13
• 公開（公告）號: CN108623652B
• 公開（公告）日: 2021-08-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李檢秀;杜奇石;黃日波;謝能中;陳先銳;黃艷燕;王青艷;秦艷
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西科學(xué)院
• 主分類號: C07K1/107
• 分類號: C07K1/107;C12N9/44
• 代理公司: 南寧深之意專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 45123
• 代理人: 黃南概

1.一種蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性改造的方法，其特征在于，待改造蛋白質(zhì)同已知結(jié)構(gòu)的模板蛋白質(zhì)的同源性50%，具體包括以下步驟：

a）選取蛋白質(zhì)家族中結(jié)構(gòu)已知的、與待改造蛋白質(zhì)同源性最高的蛋白質(zhì)為模板蛋白質(zhì)，建立待改造蛋白質(zhì)的三維同源模型結(jié)構(gòu)，得到待改造蛋白質(zhì)三維模型；

b）用分子動力學(xué)模擬計算待改造蛋白質(zhì)三維模型的分子熱運動，每個氨基酸的Cα碳原子從起始溫度t₁的玻爾茲曼平均速度開始振動，在20ns時間內(nèi)逐步升溫到終止溫度t₂，步長為Δt=0.2ps，分別記錄分子動力學(xué)模擬計算的待改造蛋白質(zhì)三維模型每個氨基酸的Cα碳原子的分子熱運動軌跡及三維坐標(biāo)，至達(dá)到溫度t₂的穩(wěn)定狀態(tài)；

c）根據(jù)待改造蛋白質(zhì)三維模型每個氨基酸的Cα碳原子在t₁和t₂時的三維坐標(biāo)，用以下計算式計算每個氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P_i：

，

所述計算式中x_t1、y_t1、z_t1分別是待改造蛋白質(zhì)三維模型每個氨基酸的Cα碳原子在溫度t₁時的三維坐標(biāo)值，x_t2、y_t2、z_t2分別是待改造蛋白質(zhì)三維模型每個氨基酸的Cα碳原子在溫度t₂時的三維坐標(biāo)值；

d）根據(jù)每個氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判斷待改造蛋白質(zhì)各部分的熱穩(wěn)定性，Pi越大，熱穩(wěn)定性越差；選取待改造蛋白質(zhì)從t₁升溫至t₂過程中，分子結(jié)構(gòu)改變較大，即Pi值較大的區(qū)域，確定待改造蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域，分析造成不穩(wěn)定的原因，并從結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部和外部加固該區(qū)域，具體方法是：（1）在不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域內(nèi)部找出距離較近，但又沒有較強相互作用的氨基酸對，通過定點變異，使之產(chǎn)生強相互作用，如氫鍵、鹽橋、酰胺橋，從內(nèi)部加固不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域；（2）觀察不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域與周圍其它部分的氨基酸的關(guān)系，找出距離較近，但又沒有較強相互作用的氨基酸對，通過定點變異，使之產(chǎn)生強相互作用，如氫鍵、鹽橋、酰胺橋，從外部加固不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域；

e）選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)上述定點變異得到的氨基酸序列，得到熱穩(wěn)定性改善的蛋白質(zhì)突變體；

所述待改造蛋白質(zhì)為脫支普魯蘭酶BDPulA324，所述BDPulA324為野生型脫支普魯蘭酶BDPulA N端截斷108個氨基酸后得到的蛋白質(zhì)，所述模板蛋白質(zhì)為2WAN，兩者同源性為64%，具體包括以下步驟：

a）將待改造的BDPulA324分子同已知結(jié)構(gòu)的模板蛋白質(zhì)2WAN分子進行三維同源建模，得到BDPulA324三維模型；

b）利用分子動力學(xué)模擬計算BDPulA324三維模型的分子熱運動，設(shè)置起始溫度t₁和終止溫度t₂，BDPulA324三維模型每個氨基酸的Cα碳原子從起始溫度t₁的玻爾茲曼平均速度開始振動，在20ns時間內(nèi)逐步升溫到溫度t₂，步長為Δt=0.2ps，分別記錄分子動力學(xué)模擬計算BDPulA324三維模型每個氨基酸的Cα碳原子的分子熱運動軌跡及三維坐標(biāo)，至達(dá)到溫度t₂的穩(wěn)定狀態(tài)；

所述起始溫度t₁和所述終止溫度t₂分別為300K和340K；

c）根據(jù)在t₁和t₂時BDPulA324三維模型的每個氨基酸的Cα碳原子三維坐標(biāo)，用以下計算式計算每個氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P_i：

，

所述計算式中x_t1、y_t1、z_t1分別是BDPulA324三維模型每個氨基酸的Cα碳原子在溫度t₁時的三維坐標(biāo)值，x_t2、y_t2、z_t2分別是BDPulA324三維模型每個氨基酸的Cα碳原子在溫度t₂時的三維坐標(biāo)值；

d）根據(jù)每個氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判斷BDPulA324各部分的熱穩(wěn)定性，Pi越大，熱穩(wěn)定性越差；選取BDPulA324三維模型從t₁升溫至t₂過程中，分子結(jié)構(gòu)改變較大，即Pi值較大的區(qū)域，確定BDPulA324的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域，分析造成不穩(wěn)定的原因，并從結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部和外部加固該區(qū)域，具體方法是：（1）在不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域內(nèi)部找出距離較近，但又沒有較強相互作用的氨基酸對，通過定點變異，使之產(chǎn)生強相互作用，如氫鍵、鹽橋、酰胺橋，從內(nèi)部加固不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域；（2）觀察不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域與周圍其它部分的氨基酸的關(guān)系，找出距離較近，但又沒有較強相互作用的氨基酸對，通過定點變異，使之產(chǎn)生強相互作用，如氫鍵、鹽橋、酰胺橋，從外部加固不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域；

e）選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，以野生型脫支普魯蘭酶BDPulA為模板，對上述方法分析得到的氨基酸位點進行定點變異，表達(dá)得到熱穩(wěn)定性改善的BDPulA突變體；

所述熱穩(wěn)定性改善是指蛋白質(zhì)活性損失一半時所需要的時間T_1/2提高5%以上，所述T_1/2的分析檢測條件為pH 4.4，溫度60℃；

所述熱穩(wěn)定性改善是指蛋白質(zhì)的殘存活力提高5%以上，所述蛋白質(zhì)的殘存活力分析檢測條件為pH 4.4，溫度60℃；

所述的定點變異為單點、兩點或三點相對于BDPulA氨基酸序列SEQ ID NO: 2中的氨基酸殘基的取代；

所述的單點突變?yōu)椋盒蛄蠸EQ ID NO: 2中的第390位的纈氨酸突變成天冬酰胺，V390N，得到BDPulA突變體V390N，具有如SEQ ID NO: 4的氨基酸序列和SEQ ID NO: 3的核苷酸序列；或序列SEQ ID NO: 2中的第390位的纈氨酸突變成絲氨酸，V390S，得到BDPulA突變體V390S，具有如SEQ ID NO: 6的氨基酸序列和SEQ ID NO: 5的核苷酸序列；

所述的兩點突變?yōu)椋盒蛄蠸EQ ID NO: 2中的第332位的天冬氨酸突變成組氨酸，序列號第398位的天冬氨酸突變成酪氨酸，D332H/D398Y，得到BDPulA突變體D332H/D398Y，具有如SEQ ID NO: 8的氨基酸序列和SEQ ID NO: 7的核苷酸序列；

所述的三點突變?yōu)椋盒蛄蠸EQ ID NO: 2中的第332位、第390位以及第398位協(xié)同突變?yōu)镈332H/V390N/D398Y或D332H/V390S/D398Y，得到BDPulA突變體D332H/ V390N/D398Y或BDPulA突變體D332H/ V390S/D398Y；

BDPulA突變體D332H/ V390N/D398Y具有如SEQ ID NO: 10的氨基酸序列和SEQ ID NO:9的核苷酸序列；

BDPulA突變體D332H/ V390S/D398Y具有如SEQ ID NO: 12的氨基酸序列和SEQ ID NO:11的核苷酸序列。