[發明專利]一種血漿直接亞硫酸氫鹽轉化的方法及其應用

在審

• 申請號: 201810203756.4
• 申請日: 2018-03-13
• 公開（公告）號: CN108265050A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 田茹;陳勇;田媛;李西蘭;余占江;陳永強
• 申請（專利權）人: 普邁德（北京）科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京恒和頓知識產權代理有限公司 11014
• 代理人: 蔡志勇

1.一種血漿直接亞硫酸氫鹽轉化的方法及其應用，其特征在于，包括如下步驟：

(1)向離心管內加入血漿、樣本處理液、蛋白酶K和亞硫酸氫鹽溶液，充分混勻，高溫條件下恒溫孵育；

(2)向上述反應液中加入20～35μL磁珠和結合液，渦旋混勻，調節恒溫振蕩器轉速800～1500rpm，溫度18～50℃，孵育20～60min，孵育結束后將反應管置于磁力架，靜置1-10min，棄去殘余液體；

(3)加入漂洗液I，充分混勻，所得反應液置于磁力架，靜置1～10min，棄去殘余液體；

(4)加入漂洗液II，充分混勻，所得反應液置于磁力架，靜置1～10min，棄去殘余液體；

(5)重復步驟(4)，室溫條件保證管內水分蒸發完全；

(6)向上述管內加入適量洗脫液45～100μL，37～60℃恒溫孵育5～15min，使結合在磁珠上的DNA充分洗脫下來，并轉移至新的不含核酸酶的離心管內，適當條件保存。

2.根據權利要求1所述，樣本處理液為Tris-HCl、二甲醚、鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或幾種組合，優選為Tris-HCl、鹽酸胍，更優選濃度為10mmol/L、pH為7.4～8.0的Tris-HCl和3～5mol/L的鹽酸胍混合液。

3.根據權利要求1所述，亞硫酸氫鹽溶液成分優選為重亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫氨、酸式亞硫酸鈉中的一種或幾種的組合，更優選為亞硫酸氫鈉和焦亞硫酸鈉的混合液，pH值優選為4.5～6.0，濃度優選為3mol/L～6mol/L，更優選為4.5mol/L；其中的保護劑成分優選為水溶性維生素E，濃度優選為0.5～20μg/ml。

4.根據權利要求1所述，其中所述高溫在50℃～95℃，優選為50℃～65℃，孵育時間為30min～24h，優選為40～60min。

5.根據權利要求1所述，磁珠為納米磁性顆粒為超順四氧化三鐵或超順三氧化二鐵顆粒，且顆粒外表由表面修飾有羥基的二氧化硅包被，本發明磁珠優選為納米磁珠，比表面積更大，核酸吸附性更強。

6.根據權利要求1所述，結合液為濃度1～8mol/L離液序列高的鹽溶液，鹽溶液如成分涉及碘化鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或鹽酸胍中的一種或多種組合，本發明優選濃度為2～6mol/L的鹽酸胍。

7.根據權利要求書1所述，漂洗液I為堿性溶液，最優選為NaOH溶液，或含有NaOH的混合液，其中NaOH濃度在5～300mmol/L。

8.根據權利1所述漂洗液II為50％～90％的乙醇溶液(分析純級別)，優選為75％。

9.根據權利1所述，洗脫液為TE溶液或無核酸酶的去離子水。

10.本發明所述血漿直接亞硫酸氫鹽轉化方法所得DNA可用于多種分子生物學下游試驗，尤其適用于甲基化特異PCR檢測(Methylation-specific PCR，MSP)，。

11.一種血漿直接亞硫酸氫鹽轉化的試劑盒，其特征在于所用方法為權利要求1所述的方法，可用于多種分子生物學下游試驗，尤其適用于甲基化特異PCR檢測(Methylation-specific PCR，MSP)。