[發(fā)明專利]一種基于體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)葉百合高效遺傳轉(zhuǎn)化體系

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810202479.5
• 申請日: 2018-03-13
• 公開（公告）號: CN108300735B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫紅梅;嚴(yán)瑞;王志平;王春夏;李宏宇
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H4/00;A01H6/56
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責(zé)任公司 21101
• 代理人: 張述學(xué)

1.一種基于體細(xì)胞胚發(fā)生的細(xì)葉百合高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，其特征在于：包括以下步驟：

（1）獲得胚性愈傷組織

選取小鱗莖直徑為1-1.2 cm的細(xì)葉百合無菌苗，將鱗片切為0.5 cm²小塊，凹面向上、平鋪接種于體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達(dá)80-90%，持續(xù)黑暗培養(yǎng)；接種6周時，形成亮黃色，顆粒性明顯的胚性愈傷組織，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至MS培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性細(xì)胞增殖，增殖4周時，篩選出長勢好而快，沒有褐化且質(zhì)地致密的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)入體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)15 d，作為轉(zhuǎn)化的受體材料；所述體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：MS ＋1.0 mg·L^-1 Picloram （毒莠定）＋0.2 mg·L^-1 NAA （萘乙酸）；

（2）抗生素敏感性測定

通過在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度梯度的抗生素，測定硫酸卡那霉素和潮霉素對于細(xì)葉百合胚性愈傷組織的亞致死濃度，確立硫酸卡那霉素和潮霉素的抗性篩選使用濃度分別為100 mg·L^-1和30 mg·L^-1；

（3）優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化條件

比較轉(zhuǎn)化過程中不同轉(zhuǎn)化條件轉(zhuǎn)化后的GUS瞬時表達(dá)率和抗性篩選2個月后的抗性愈傷發(fā)生率，確定轉(zhuǎn)化條件如下：受體材料預(yù)培養(yǎng)15 d，菌液濃度OD₆₀₀為0.6，侵染時間10min，固體共培養(yǎng)48h；

（4）制備農(nóng)桿菌侵染液

將攜帶目標(biāo)基因的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，利用載體相應(yīng)的抗生素篩選和菌落PCR鑒定出陽性的轉(zhuǎn)化子；挑取陽性的轉(zhuǎn)化子克隆，接種于含相應(yīng)抗生素的5 mL新鮮YEB液體培養(yǎng)基中200 rpm振蕩培養(yǎng)至菌液較濃，吸取菌液按1：50的比例轉(zhuǎn)接到50 ml液體YEB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.6，5000 rpm離心10 min，收集菌體；用50 mL含有100 μM 乙酰丁香酮(AS) 的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，將重懸液繼續(xù)200 rpm振蕩培養(yǎng)2 h，作為農(nóng)桿菌侵染液備用；所述的攜帶目標(biāo)基因的載體包括pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA3300、pCAMBIA3301、pRI201、pTCK303、pTCK-S1-Ri；

（5）侵染和共培養(yǎng)

在超凈工作臺內(nèi)，將生長狀態(tài)良好的細(xì)葉百合胚性愈傷組織塊浸沒于農(nóng)桿菌侵染液中10 min，期間不斷輕輕搖晃以便使組織塊與侵染液充分接觸；從侵染液中取出組織塊后，用無菌濾紙充分吸干組織塊表面的殘留菌液，再轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，25±1℃進(jìn)行持續(xù)黑暗培養(yǎng)48 h；

所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：MS＋1.0 mg·L^-1Picloram (毒莠定) ＋0.2 mg·L^-1 NAA(萘乙酸) ＋100 μM AS (乙酰丁香酮)；

（6）抗性愈傷組織的篩選與繼代培養(yǎng)

將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)接于脫菌培養(yǎng)基，于25±1℃暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行脫菌培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)，2周后將完全脫菌的愈傷組織轉(zhuǎn)接至抗性愈傷篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，此后每2周轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)4周抗性愈傷組織上會新生出體細(xì)胞胚；所述脫菌培養(yǎng)基配方為：MS＋1.0 mg·L^-1Picloram (毒莠定) ＋0.2 mg·L^-1 NAA (萘乙酸) ＋400 mg·L^-1 cef (頭孢霉素) ＋30 mg·L^-1 Hyg (潮霉素)；所述抗性愈傷篩選培養(yǎng)基配方包括：MS＋1.0 mg·L^-1Picloram (毒莠定) ＋0.2 mg·L^-1 NAA (萘乙酸) ＋30 mg·L^-1 Hyg(潮霉素)；

（7）體細(xì)胞胚萌發(fā)和成苗

篩選培養(yǎng)結(jié)束后，切除愈傷基部壞死的組織，將長出體細(xì)胞胚的胚性培養(yǎng)物轉(zhuǎn)于體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為25±1℃，采用不透氣封口膜，保證組培瓶內(nèi)濕度達(dá)80-90%，每天16小時光照，8小時黑暗，光照強(qiáng)度為36 μmol·m^-2·s^-1；培養(yǎng)4周可形成具有子葉和根的成熟體細(xì)胞胚，將成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)接至MS基本培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，2周后發(fā)育形成完整的轉(zhuǎn)化植株；所述體胚萌發(fā)培養(yǎng)基配方包括：MS＋0.5 mg·L^-16-BA(6-芐氨基腺嘌呤)；

（8）轉(zhuǎn)化植株的轉(zhuǎn)基因鑒定

a. GUS組織學(xué)染色：對轉(zhuǎn)化植株的葉片、鱗片、根分別進(jìn)行常規(guī)GUS組織染色，以未轉(zhuǎn)化的野生型植株作為對照，如果成功染色說明攜帶標(biāo)記基因的載體成功整合到植株基因組中；

b. PCR檢測：對成功染色的植株提取基因組DNA，針對載體T-DNA區(qū)域內(nèi)的DNA序列設(shè)計特異引物，以細(xì)葉百合基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以野生型植株作對照，若轉(zhuǎn)化植株的PCR結(jié)果為陽性，則表明外源基因整合到了植株的基因組中。