[發明專利]基于CRISPR/Cas9技術構建的LMNA基因敲除的細胞系

有效

• 申請號: 201810193932.0
• 申請日: 2018-03-09
• 公開（公告）號: CN108410911B
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 舒偉;劉恒;楊曉波;李東明;李福記;朱蘭玉
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N5/10;C12N15/85;C12R1/91
• 代理公司: 廣州文冠倪律知識產權代理事務所(普通合伙) 44348
• 代理人: 倪小敏

本發明公開了LMNA基因敲除的細胞系，所述細胞系為293T細胞系或HePG2腫瘤細胞系。所述細胞系是基于crispr?cas9技術利用SEQ ID NO.1?4所示的兩對gRNA或SEQ ID NO.7?10所示的兩對gRNA構建的質粒載體轉染待敲除細胞，經抗性篩選得到。所述LMNA基因敲除的細胞系可以用于擴心病、脂肪代謝障礙綜合征、早衰綜合征等疾病干預藥物篩選細胞模型。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及基于CRISPR/Cas9技術構建的LMNA基因敲除的細胞系及其構建方法。

背景技術

近幾年發展起來的 CRISPR/Cas9 基因組定向編輯技術能夠實現對基因組的特異性和精確敲除。基因組定向編輯技術可以導致目標位點的缺失、插入或替換。繼 ZFN 和TALEN 技術之后，CRISPR/Cas9 系統已經迅速發展為第 3 代基因組編輯技術。CRISPR/Cas9 系統是 CRISPR/Cas 系統Ⅱ經過改造而成。與 ZFN 和 TALEN 技術相比，CRISPR/Cas9 系統在設計、合成和篩選上都非常簡便，而且易于操作、成本低、構建周期短并且可以實現同時對多個基因的編輯，成倍的提高對基因編輯的效率。

LMNA 基因位于染色體的 1q21.2-q21.3，基因組序列全長 56.7 kb，含有 12 個外顯子，在 10 號外顯子上選擇性剪接產生 2 種 mRNA，分別編碼 lamin A 和 lamin C蛋白。這兩種蛋白與LMNB 基因編碼的 Lamin B 蛋白共同組成細胞的核纖層（nuclearlamin）。核纖層緊貼于內層核膜（inner nuclear membrance）的內表面，它與中等纖維蛋白家族具有高度的同源性，在維持核膜完整性、提供染色體錨著位點、調節細胞的分化及核周期性的解體和重組裝過程中發揮重要作用。Lamin A 能與特定的結構蛋白相互作用,從而在核膜處形成復雜而牢固的網絡結構,進一步增強了細胞核的穩定性。Lamin 還能夠與眾多轉錄因子相互作用，共同參與細胞內信號通路和轉錄的調控,對細胞的增殖、分化和凋亡等生命過程起重要的調控作用。近年來的研究表明，LMNA 基因突變與人類一系列疾病密切相關，這類疾病統稱為核纖層?。╨aminopathy）。LMNA 基因突變主要導致以神經和肌肉癥狀為主要特征的疾病。Worman 和 Bonne 報道了人 LMNA 基因突變與擴張性心肌病、脂肪代謝障礙綜合征、早衰綜合征等疾病有關。

目前對于LMNA基因與疾病的關系的研究仍然不夠充分，并且缺少相應的基因敲除細胞系，因此有必要提供LMNA基因敲除的細胞模型，從而為科研提供必要的工具。

發明內容

本發明一方面提供一種LMNA基因敲除的細胞系。在一個實施方式中，該LMNA基因敲除的細胞系是293T細胞。在一個實施方式中，該LMNA基因敲除的細胞系是HePG2腫瘤細胞。

本發明另一方面提供構建LMNA基因敲除的細胞系的方法，所述方法基于crispr-cas9技術利用SEQ ID NO. 1-4所示的兩對gRNA或SEQ ID NO. 7-10所示的兩對gRNA構建的質粒載體轉染待敲除細胞，經抗性篩選得到所述LMNA基因敲除的細胞系。

本發明另一方面提供一種質粒載體，其包含SEQ ID NO. 1-4所示的兩對gRNA或SEQ ID NO. 7-10所示的兩對gRNA。

本發明再一方面提供所述質粒載體的應用，其用于基于crispr-cas9技術構建LMNA基因敲除的細胞系。

本發明利用發明人設計的gRNA成對引物能夠精確且高效地敲除LMNA基因，所提供的LMNA基因敲除的細胞系能夠為衰老和擴張性心肌病干預藥物提供細胞模型，能夠為LMNA基因調控的相關基因影響細胞周期和凋亡提供對照細胞模型，并且能夠為LMNA基因與腫瘤發生發展和藥物干預提供細胞模型。

附圖說明

圖1是LMNA基因敲除的293T細胞PCR測序結果。