[發(fā)明專利]一株高底物專一性酰基轉(zhuǎn)移酶的珍貴束絲放線菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810191854.0
• 申請日: 2018-03-08
• 公開（公告）號(hào): CN108330113B
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹廣祥;宗工理;鐘傳青;付加芳
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心（山東省病毒研究所）
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N15/74;C12N1/21;C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

本發(fā)明公開了一株高底物專一性酰基轉(zhuǎn)移酶的珍貴束絲放線菌，為珍貴束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)X4732,已于2018年2月5日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC NO.60327。本發(fā)明采用連續(xù)易錯(cuò)PCR方法體外突變酰基轉(zhuǎn)移酶的基因，以酰基轉(zhuǎn)移酶缺失菌株為出發(fā)菌，通過接合轉(zhuǎn)移技術(shù)建立含有酰基轉(zhuǎn)移酶基因的突變體庫，篩選獲得正突變株，通過發(fā)酵驗(yàn)證、傳代培養(yǎng)獲得遺傳性狀穩(wěn)定的珍貴束絲放線菌X4732。本發(fā)明菌株的安絲菌素AP?3合成水平比原始菌株X47高2.7倍，可應(yīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物育種和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高活性酶的珍貴束絲放線菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

安絲菌素(ansamitocin)是由珍貴束絲放線菌(Actinosynnema pretiosum)產(chǎn)生的安莎類抗生素。安絲菌素是一類高效的抗腫瘤藥物，研究證實(shí)安絲菌素能夠通過與微管結(jié)合抑制60種腫瘤細(xì)胞的增殖，臨床試驗(yàn)表明安絲菌素藥物對肺腺癌、肺鱗癌和肺肥大細(xì)胞癌等均有療效。由于安絲菌素具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，一般利用抗體的靶向作用將藥物分子靶向腫瘤，從而降低臨床化療中藥物的非特異性全身毒性。羅氏公司的抗癌藥物Trastuzumab-DM1(T-DM1)是第一個(gè)成功上市的安絲菌素抗體偶聯(lián)藥物(DM1是安絲菌素的衍生物)，2013年被FDA批準(zhǔn)治療HER2受體陽性的乳腺癌轉(zhuǎn)移和晚期病人。另外，還有多個(gè)安絲菌素衍生物的抗體偶聯(lián)藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，比如：SAR-408701由癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5和安絲菌素衍生物DM1組成，用于治療實(shí)體腫瘤；BT-062由靶向CD138的單克隆抗體和安絲菌素衍生物DM1和DM4組成，用于治療多發(fā)性骨髓瘤；SAR3419由人源化抗-CD19單克隆抗體和安絲菌素衍生物DM4組成，用于治療包括非霍奇金淋巴瘤的B-細(xì)胞惡性腫瘤。

珍貴束絲放線菌發(fā)酵法生產(chǎn)安絲菌素獲得的是一類安絲菌素混合物，主要含有AP-2、AP-3和AP-4組份，AP-2、AP-3和AP-4之間的差異在于C-3位羥基連接的酰基側(cè)鏈不同，例如AP-2為丙酰基，AP-3為異丁酰基，AP-4為異戊酰基(如圖1所示)。其中AP-3組份是用于開發(fā)安絲菌素衍生物的中間體，通過化學(xué)合成可以將AP-3轉(zhuǎn)化成DM1和DM4等衍生物并用于抗體偶聯(lián)藥物開發(fā)，但是一般發(fā)酵液中AP-3組份僅占60％左右。此外，安絲菌素AP-3的發(fā)酵產(chǎn)量也偏低，嚴(yán)重影響安絲菌素的工業(yè)化生產(chǎn)，也為安絲菌素抗體偶聯(lián)藥物的新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用帶來阻礙。因此研發(fā)安絲菌素AP-3高產(chǎn)菌株具有非常重要的工業(yè)價(jià)值。

野生型珍貴束絲放線菌的安絲菌素AP-3產(chǎn)量很低，所以現(xiàn)有的珍貴束絲放線菌工業(yè)菌株都是通過多輪誘變篩選得到的突變株，但是常規(guī)誘變育種技術(shù)的效率較低，成為制約安絲菌素AP-3生產(chǎn)技術(shù)提高的一個(gè)瓶頸。

酰基轉(zhuǎn)移酶是安絲菌素前體添加異丁酰基側(cè)鏈合成安絲菌素AP-3的關(guān)鍵酶，該酶活性提高時(shí)能夠提高向安絲菌素添加異丁酰基側(cè)鏈的催化效率，因此通過對酰基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行基因改造有望獲得安絲菌素AP-3高產(chǎn)菌。但是酰基轉(zhuǎn)移酶不僅具有催化異丁酰基修飾安絲菌素的活性，還能催化其他酰基修飾安絲菌素的活性，目前還不知道這些修飾作用的專一性與那些位點(diǎn)有關(guān)。由于基因改造的位點(diǎn)難以選擇，目前尚未有關(guān)于對酰基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行基因改造而獲得安絲菌素AP-3高產(chǎn)菌的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一株高底物專一性酰基轉(zhuǎn)移酶的珍貴束絲放線菌及其應(yīng)用。采用定向進(jìn)化的策略，對克拉維胺酸氨基乙酰化酶進(jìn)行定向改造，并配合高通量篩選技術(shù)獲得高底物專一性酰基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)而得到安絲菌素AP-3高產(chǎn)菌株。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種高底物專一性酰基轉(zhuǎn)移酶，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種編碼SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基因。