[發明專利]VdPHB基因在抗棉花黃萎病菌中的應用

有效

• 申請號: 201810188551.3
• 申請日: 2018-03-07
• 公開（公告）號: CN108517007B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 左開井;韓松;段興鵬
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K14/37
• 分類號: C07K14/37;C12N15/31;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/60
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 莊文莉

本發明涉及作物病害領域，提供了一種VdPHB基因在抗棉花黃萎病菌中的應用，所述VdPHB基因編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ.ID.NO:2所示。通過對敲除突變體ΔVdphb的菌落形態、生長速率、胞外酶活性以及致病力進行測定，并和野生型的各項指標進行比較分析，確定VdPHB基因是棉花黃萎病菌致病基因，在黃萎病菌中抑制VdPHB基因表達可以降低黃萎病菌的危害。

技術領域

本發明涉及作物病害領域，具體涉及一種棉花黃萎病菌的致病基因VdPHB作為抗棉花黃萎病菌靶標基因的應用。

背景技術

在作物整個生產過程中，作物會遭遇各種各樣的病害，給作物生產造成了極大的經濟損失。其中，真菌引起的病害最為嚴重，真菌病害產生的損失約占作物總損失的70-80％。通過研究病原真菌的致病機制分離致病基因，并通過抑制致病基因的表達來控制真菌病害發生以及危害程度是作物病害防治的新途徑。

棉花黃萎病是一種由大麗輪枝菌引起的土傳性維管束真菌病害。由于大麗輪枝菌的生理型多、突變快、致病機理復雜所以導致棉花黃萎病很難防治。1935年棉花黃萎病通過引進的美國棉種“斯字棉”傳入我國。在二十世紀五十年代棉花黃萎病快速傳播，在八十年代末棉花黃萎病已經遍及我國各個棉區。進入九十年代后棉花黃萎病出現大面積爆發，尤其是1993年我國棉花黃萎病大爆發，被黃萎病感染的面積達到267萬公頃、造成絕收的棉田達到13.8萬公頃，損失皮棉約1億公斤。之后在2003、2004、2006年再次大發生造成重大損失。據2012年國際輪枝菌大會報道統計，在2005-2010年間棉花平均產量2352萬噸，由棉花黃萎病造成的損失高達30％，直接經濟損失達到106億美元。我國棉花生產總量占全球產量的四分之一，目前還沒有有效防治棉花黃萎病的手段，棉花一旦被感染就會導致棉花產量以及纖維品質的大幅下降。棉花黃萎病因而被稱為“棉花的癌癥”，已經成為我國棉花穩產、高產、優產的主要障礙之一。

大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)屬半知菌亞門、叢梗孢目、淡色孢科、輪枝菌屬。大麗輪枝菌可以感染600多種不同的作物，具有廣泛的寄主范圍，寄主包括蔬菜(茄子、胡椒、馬鈴薯、番茄)、水果(葡萄、橄欖和草莓)、觀賞花卉(菊花)、油籽作物(向日葵)、纖維作物(亞麻)和木本多年生作物。大麗輪枝菌致病機理有堵塞假說和毒素假說。研究人員認為菌體侵入到作物體內在導管中定產生大量菌絲，同時激發作物體內防御反應，使作物導管中產生膠狀物質。菌絲和作物產生的膠狀物體堵塞作物導管，阻礙水分的運輸從而導致作物萎蔫。

毒素學說認為大麗輪枝菌侵入到寄主植株中后會分泌一些有毒蛋白或次級代謝產物，例如糖蛋白、細胞壁降解酶等來抑制寄主的防御反應從而引起細胞的凋亡，進而引起寄主的枯萎死亡。研究學者在大麗輪枝菌的粗提取的分泌物中分別加入蛋白降解酶和脂質降解酶后發出加入蛋白降解酶的提取物不再具有致病性，由此可以確定大麗輪枝菌分泌的致病毒素中蛋白質的成分具有重要的作用。因此，抑制黃萎病菌的擴展能夠有效降低棉花黃萎病的危害。

為了進一步了解棉花黃萎病菌的致病機理，世界各國的研究學者開展了大量的研究。目前，研究人員從建立的大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫中篩選到一些相關的致病基因。其中，一個編碼富含谷氨酸的蛋白質(VdGARP1)，當將其敲除以后發現突變體的黑色素產生會受到影響。至關重要的是，ΔVdGARP1突變體的致病力明顯降低。在大麗輪枝菌中還發現Vayg1同樣參與黑色素的生成，ΔVayg突變體在BMM板上接種分生孢子之后分析大麗輪枝菌6種黑色素生物合成相關基因的表達情況，發現6種基因的表達量均表達下調，ΔVayg突變體產生了少量的微菌核和黑色素。在致病力方面，ΔVayg突變體的致病力下降，在入侵定殖定殖時發現其入侵定殖受到抑制，而且致病力也比野生型低，說明VAYG不僅僅參與了微菌核和和黑色素的形成還與黃萎病的致病相關。大麗輪枝菌微菌核萌發產生菌絲或芽管，它們在根部表面縱向延伸，隨后會觀察到一些腫狀的菌絲在細胞表皮連接處穿孔形成狹窄的穿透栓幫助大麗輪枝菌侵染定殖。