[發(fā)明專利]一種針對5`-UTR基因檢測短喙矮小綜合征鵝細(xì)小病毒的PCR引物

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810183223.4
• 申請日: 2018-03-06
• 公開（公告）號: CN108486280B
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王劭;陳少鶯;肖世峰;陳仕龍;程曉霞;林鋒強;俞博;朱小麗
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

本發(fā)明公開了一對針對5’?UTR基因檢測短喙矮小綜合征鵝細(xì)小病毒的PCR引物，其引物由上游和下游引物組成，上游引物及其寡核苷酸序列為SBDS?GPV?F1：5’?GCACGTGACAGGATGTGCGTCA?3’；下游引物及其寡核苷酸序列為SBDS?GPV?R1：5’?GCGCGCAAAATATTTTCT?3’。本發(fā)明的引物特異性高、且片段小，敏感性高，整個PCR過程可以在2 h內(nèi)完成，能夠特異性檢測出短喙矮小綜合征鵝細(xì)小病毒的存在，可以有效避免短喙矮小綜合征鵝細(xì)小病毒PCR檢測假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測短喙矮小綜合征鵝細(xì)小病毒的引物，屬于畜牧獸醫(yī)檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

短喙與矮小綜合征鵝細(xì)小病毒（short beak and dwarfism syndrome-gooseparvovirus，SBDS-GPV）是細(xì)小病毒科依賴病毒屬成員，為泛組織嗜性單鏈DNA病毒，臨床上主要引起半番鴨和櫻桃谷鴨以生長障礙、短喙、舌頭外露、易骨析為特征的高度接觸性傳染病，在人工感染條件下，其對不同品種水禽均有感染性。本病最早由Villatte D.報道在法國半番鴨群中流行，2009年匈牙利Palya V.分離鑒定了病原，并命名為SBDS-GPV，2015年陳少鶯等在中國大陸南方半番鴨與櫻桃谷鴨群中檢測到SBDS-GPV感染，從發(fā)病半番鴨組織中分離到SBDS-GPV并進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定。隨著水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，短喙矮小綜合征已經(jīng)成為目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的重要傳染病之一，給養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

鵝細(xì)小病毒（goose parvovirus，GPV）基因組中間為編碼區(qū)存在兩個開放閱讀框，從左往右依次為Rep基因和VP基因，編碼區(qū)兩側(cè)是包含有倒置末端重復(fù)序列的非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）。VP基因編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3。VP3是GPV主要的免疫原性蛋白，能夠在自然感染條件下誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此VP3常做為GPV分子生物學(xué)診斷的首選目標(biāo)基因。GPV只有一種血清型，SBDS-GPV與經(jīng)典小鵝瘟病毒（classicalGPV，C-GPV）、基因重組型番鴨小鵝瘟病毒（Muscovy duck-origin GPV，MDGPV）分離株密切相關(guān)，VP3基因核苷酸序列同源性達(dá)91%～96%，與番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duckparvovirus，MDPV）分離株VP3基因序列同源性為84%～85%。目前，針對SBDS-GPV建立的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法（常規(guī)PCR、熒光定量PCR、PCR-LAMP）均以SBDS-GPV VP3基因核苷酸序列為基礎(chǔ)而設(shè)計引物，因此PCR引物特異性不高，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，常將C-GPV、MDGPV和MDPV誤判為SBDS-GPV；實驗室鑒別SBDS-GPV基因特征的方法還是主要依據(jù)病毒基因組的核苷酸序列測定分析，然而在基層實驗室日常檢測工作中，針對大量臨床感染樣本的測序存在成本高、操作繁瑣、耗時長等缺點，不適用于疫病的快速鑒別診斷和分析工作。因此，建立快速、特異、靈敏的SBDS-GPV分子生物學(xué)檢測方法十分重要。

不同疾病型GPV各分離株之間基因組核苷酸序列存在廣泛的變異，尤其以5’末端非編碼區(qū)（5’-untranslated region，5’-UTR）序列變異最大，并且具有耐受堿基突變、插入或缺失的能力。與GenBank中C-GPV、MDGPV和MDPV標(biāo)準(zhǔn)株全長基因多序列比對發(fā)現(xiàn)，SBDS-GPV代表株的5’-UTR基因在第250～400位核苷酸序列內(nèi)存在連續(xù)15個堿基的獨特缺失以及多處連續(xù)堿基突變，因此可以根據(jù)此段序列設(shè)計特異性PCR引物對SBDS-GPV DNA進(jìn)行檢測。目前國內(nèi)外還未見到針對5’-UTR設(shè)計特異性引物檢測SBDS-GPV的研究報道。我們在大量分析GPV和MDPV不同分離株基因組序列基礎(chǔ)上，在國內(nèi)外首次針對5’-UTR序列設(shè)計用于檢測SBDS-GPV的特異性PCR引物，能夠有效避免SBDS-GPV核酸檢測過程中假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。本發(fā)明的建立可填補國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的空白。

發(fā)明內(nèi)容