[發(fā)明專利]玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)基因Rf4位點(diǎn)緊密連鎖分子標(biāo)記及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810182440.1
• 申請(qǐng)日: 2018-03-06
• 公開（公告）號(hào): CN108531635A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 薛亞東;湯繼華;付志遠(yuǎn);丁冬;李衛(wèi)華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州龍宇專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 41146
• 代理人: 陳亞秋

1.玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)基因Rf4位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記 X-21-1和X33，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

2.玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)基因Rf4位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物，包括以下引物對(duì)：

X-21-1擴(kuò)增引物對(duì)：

X-21-1F：5’-TTTCTTCTCAGGGTGGTCTTGC-3’，

X-21-1R：5’-CACCTTTCCACCTCGCCTATT-3’；

X33擴(kuò)增引物對(duì)：

X33F：5’-CACACACGAGGGGAGGAGGT-3’，

X33R：5’-AAGGTCTTTGTTGTCGGGCA-3’。

3.玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)基因Rf4位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記 X-21-1和X33的擴(kuò)增反應(yīng)體系，每15μL含有：10×PCR Buffer 2.0μL，2.5mmol/L的 dNTPs 0.3μL，5U/μL的Taq酶0.2μL，10ng/μL的引物 2.0μL，DNA 5.0μL，ddH₂O 5.5μL；所述DNA用堿裂解法提取自玉米種子，所述引物由等物質(zhì)的量的X-21-1F、X-21-1R、X33F和X33R組成。

4.玉米C型細(xì)胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)基因Rf4位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記 X-21-1和X33的擴(kuò)增反應(yīng)體系，每15μL含有：10×PCR Buffer 1.5μL，25mmol/L的Mg²⁺ 1.0μL，25mmol/L的dNTPs 0.3μL，5U/μL的Taq酶 0.1μL，50ng/μL的引物 1.5μL，20ng/μL的DNA 3.0μL，ddH₂O7.6μL；所述DNA用CTAB法提取自玉米種子，所述引物由等物質(zhì)的量的X-21-1F、X-21-1R、X33F和X33R組成。

5.利用權(quán)利要求2所述引物擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的反應(yīng)程序，依次包括：95℃2min；8個(gè)循環(huán)的95℃ 1min、65~58℃ 1min和72℃ 1min，65~58℃為從65℃開始每循環(huán)降低1℃至58℃；29個(gè)循環(huán)的95℃ 1min、58℃ 1min和72℃ 1min；72℃ 5min。

6.權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記或權(quán)利要求2所述擴(kuò)增引物在不育化制種中的應(yīng)用。