[發明專利]一種以胞外高分子聚合物包埋緩釋磷肥的實驗方法

在審

• 申請號: 201810181669.3
• 申請日: 2018-03-06
• 公開（公告）號: CN108254509A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 余金龍
• 申請（專利權）人: 余金龍
• 主分類號: G01N33/00
• 分類號: G01N33/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種以胞外高分子聚合物包埋緩釋磷肥的實驗方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)選取材料：

a.供試菌株

解磷菌菌株PMKN150713，篩選自金銀花莖下端，經研磨、離心并用無N、PKO和孟金娜固體培養基篩選而得；

b.培養基

b1.篩選培養基:

1)無N固體培養基：磷酸氫二鉀50gL^-1、母液5mLL^-1、氯化鈉25gL^-1、甘露醇10gL^-1、瓊脂15gL^-1、蒸餾水1L，PH7±0.5，121℃濕熱滅菌26min制成固體平板；母液的制備：磷酸二氫鉀50gL^-1、2水合鉬酸鈉1gL^-1、7水硫酸鎂25gL^-1、4水硫酸錳1gL^-1、氯化鈉25gL^-1、7水硫酸鐵1gL^-1；

2)PKO固體培養基：葡萄糖10gL^-1、磷酸鈣5gL^-1、硫酸銨0.5gL^-1、氯化鈉0.2gL^-1、氯化鉀0.2gL^-1、7水硫酸鎂0.3gL^-1、硫酸錳0.03gL^-1、硫酸亞鐵0.003gL^-1、酵母粉0.5gL^-1、瓊脂粉18gL^-1、蒸餾水1L，磷酸鈣5gL^-1過篩后滅菌與培養基混合，pH 7.0±0.2，121℃濕熱滅菌26min制成平板；

3)蒙金娜固體培養基：葡萄糖10gL^-1、卵磷脂0.2gL^-1、硫酸銨0.5gL^-1、氯化鈉0.3gL^-1、氯化鉀0.3gL^-1、碳酸鈣5gL^-1、4水硫酸錳0.03gL^-1、7水硫酸亞鐵0.03gL^-1、酵母膏0.4gL^-1、瓊脂粉20gL^-1、蒸餾水1L，pH 7.0±0.2，121℃濕熱滅菌26min制成平板；

b2.發酵培養基:

1)YEM液/固體培養基：磷酸氫二鉀0.5gL^-1、硫酸鎂0.2gL^-1、氯化鈉0.1gL^-1、甘露醇10gL^-1、酵母粉1gL^-1、蒸餾水1L、瓊脂粉15gL^-1，PH7±0.2，121℃濕熱滅菌26min制成液/固體培養基；

2)CSE液體培養基：秸稈粉10gL^-1，400ml80℃溫水浸提10min，用雙層濾紙過濾，取全部濾液定容至500ml，121℃濕熱滅菌26min；制成液得到1：50的CSE原液滅菌后避光保存備用，使用時需稀釋一倍，PH7±0.2；

3)察氏液體培養基：硝酸鉀3gL^-1、磷酸氫二鉀1gL^-1、七水硫酸鎂0.5gL^-1、氯化鈉0.5gL^-1、硫酸亞鐵0.01gL^-1、蔗糖30gL^-1、蒸餾水1L，PH7±0.2，121℃濕熱滅菌26min制成液體培養基；

C.供試碳源、氮源

碳源：蔗糖、葡萄糖、甘露醇和丁二酸；氮源：蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、硫酸銨和磷酸銨；

d.速溶性磷肥：磷酸二氫銨

(2)制備EPS，搖瓶發酵，將菌株PMKN150713轉接于YEM、CSE和察氏液體培養基中，28℃發酵培養5d，以獲得EPS；

(3)產EPS干物質量的計算：每個樣品取5g培養液，60℃鼓風干燥烘箱烘至恒重，測樣品干重；

(4)發酵基礎培養基類型比較：在保持培養基中其他組分不變，分別以YEM培養基、CSE培養基和察氏培養基進行搖瓶發酵，以所產EPS的干物質的量和粘度為主要評價指標，根據不同培養基下定量發酵液的干物質量和粘度來確定最佳基礎培養基；

(5)碳源、氮源的優化：通過單因素法對培養基中的碳源和氮源進行對比實驗，找出最佳菌種產EPS的培養基碳氮源；其中：

1)碳源對PMKN150713菌發酵產EPS的影響

在保持培養基中其他組分不變，分別以原配方用量的蔗糖、葡萄糖、甘露醇和丁二酸代替基礎發酵培養基中的碳源，進行搖瓶發酵，以EPS的粘度和定量發酵液的干物質量為主要評價指標，根據不同碳源條件下EPS的產出率，測干物質重量和粘度確定培養基中最佳碳源；

2)氮源對PMKN150713菌發酵產EPS的影響

在保持培養基中其他組分不變，以原配方用量的蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、硫酸銨和磷酸銨代替基礎發酵培養基中的氮源，進行搖瓶發酵，以EPS的干物質量和培養液粘度為評價指標，根據不同氮源條件下的EPS產干物質量和粘度確定最佳氮源；

(6)EPS粘度的測定：使用品氏粘度計測量培養液的粘性動力系數，進而確定不同培養基、C、N源對解磷菌產胞外聚合物粘度的影響，以不同培養基C、N源所產多糖的粘度為評價指標，確定EPS粘度最大的最佳培養基和N、N源；

(7)緩釋磷肥試制：培養物經雙層濾紙過濾后，含有大量活菌的黏稠EPS解磷固氮菌培養物，按每5g加入0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g磷酸二氫銨的量做6個對照組，用玻璃棒混合均勻，分別以烘箱低溫28℃烘干、常溫自然干燥、常溫減壓硅膠室干燥法和不干燥進行處理，并進行各對照組及干燥方法滅菌與不滅菌處理對照；

(8)包肥含水量的計算：先稱每個對照組、重復組包肥的鮮重，然后108℃高溫烘干至恒重，測得干重，用濕、干重差除以濕重即是包肥含水量；

(9)包肥含菌量的測定：以平板稀釋法記錄并統計，由所取樣品質量、稀釋倍數、涂抹和取樣量換算包肥含菌數；

最大可能菌數cfu·g-1＝B×C/D×E/A

注：A:原材料質量g B:研磨液體積ml C:稀釋倍數

D:涂抹液體積ml E:培養基菌落數

(10)磷溶出率的計算：包埋緩釋磷肥的磷溶出率是鑒定樣品能夠減緩速溶性磷肥溶出包肥的程度，從而判斷包埋有無意義，計算樣品初期溶出率和微分溶出率：

1)初期溶出率：稱取1g樣品包肥，加入20倍重的水，28℃恒溫侵泡24h，取出侵泡液，用土壤養分測試儀土壤類試劑測其P含量，每個處理重復3次；

初期溶出率％＝第一天浸出的養分量/試樣中該養分的含水量×100％

2)微分溶出率：稱取1g樣品包肥，加入20倍重的水，28℃恒溫侵泡7天，取出侵泡液，用土壤養分測試儀土壤類試劑測其P含量，每個處理重復3次。

微分溶出率％＝(溶解的成分量/試樣中該成分的含量×100％-初期溶出率)×1/(放置天數-1)

(11)數據分析：數據為平均值±標準誤means±SE，每處理4重復，制作出相關柱狀圖進行對比分析，同列柱狀圖上方不同小寫字母表示處理之間差異顯著性。