[發明專利]一種用SLFN13從總RNA中純化總mRNA的方法

有效

• 申請號: 201810181007.6
• 申請日: 2018-03-06
• 公開（公告）號: CN108486098B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 高嵩;楊金玉;謝偉;鄧翔宇
• 申請（專利權）人: 中山大學腫瘤防治中心（中山大學附屬腫瘤醫院;中山大學腫瘤研究所）
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

1.一種用SLFN13從總RNA中純化總mRNA的方法，其特征在于：具體步驟如下：

(1)總RNA提取：利用傳統的TRIzol-氯仿方法從樣品中提取完整的總RNA；

(2)tRNA與rRNA的酶切：純化10ug總RNA，取10ul濃度為1ug/ul的總RNA，加入1ul 50uM的SLFN13，加2ul 10×酶切緩沖液，加7ul ddH₂O配成20ul的酶切體系；10×酶切緩沖液的成分為：400mM Tris-HCl，pH為8.0,200mM KCl,40mM MgCl₂和20mM DTT；室溫孵育酶切30min即可；

(3)酶切結束后于70℃加熱15分鐘將SLFN13-N失活，獲得純化的總mRNA；

其中，步驟(2)的SLFN13為GenBank數據庫Gene ID:146857的氨基酸序列1-355位的人源SLFN13的N端結構域，或是GenBank數據庫Gene ID:303378的氨基酸序列1-353位的大鼠SLFN13的N端結構域。

2.根據權利要求1所述的用SLFN13從總RNA中純化總mRNA的方法，其特征在于：步驟(1)中所述的樣品為細胞樣品或組織樣品中的一種。

3.根據權利要求1所述的用SLFN13從總RNA中純化總mRNA的方法，其特征在于：所述的SLFN13的N端結構域，通過以下的表達純化方法制備獲得：

將SLFN13的N端結構域構建到pET28載體，測序驗證正確后，將質粒轉化入Rossetta(DE3)表達菌株；挑取單克隆入100ml添加卡那霉素和氨芐霉素雙抗的LB培養基中預培養，12-16hr后將菌液按照1：100的比例轉入5L添加雙抗的TB培養基中在37℃擴大培養，待OD到0.4-0.6時，降溫至17℃，加入80uM IPTG誘導表達SLFN13-N蛋白；低溫誘導表達16-20h后，離心收集菌體并破碎釋放蛋白；SLFN13-N的N末端含有一個6×His-tag用鎳基質進行親和純化，最后用凝膠柱分子篩分選出均質單一的蛋白組分，濃縮至約2ug/ul備用，凍存于-80℃保存。

4.根據權利要求1所述的用SLFN13從總RNA中純化總mRNA的方法，其特征在于：在第(3)步將酶失活之后，結合相應的small RNA純化試劑盒將酶切后的tRNA和rRNA碎片去除，得到總mRNA。