[發明專利]基于微流控芯片檢測多種病原體的試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201810180333.5
• 申請日: 2018-03-05
• 公開（公告）號: CN108531556A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 許行尚;杰弗瑞·陳;王龍;于沛;張蓉蓉
• 申請（專利權）人: 南京嵐煜生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6837
• 分類號: C12Q1/6837;C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/35;C12R1/01
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 路中丹

1.一種基于微流控芯片的檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括有主動控制流路的多通量微流控核酸檢測芯片、預裝干粉檢測試劑和陽性質控品；所述預裝干粉檢測試劑含有肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的特異性保守序列的引物及Taqman熒光探針；

其中，特異性保守序列的引物序列為：

肺炎支原體，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

肺炎衣原體，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；

嗜肺軍團菌，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；

特異性Taqman探針序列為：肺炎支原體，SEQ ID NO.3；

肺炎衣原體，SEQ ID NO.6；

嗜肺軍團菌，SEQ ID NO.9。

2.根據權利要求1所述的基于微流控芯片的檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的試劑盒，其特征在于，所述預裝干粉檢測試劑還包括有PCR緩沖液、海藻糖、牛血清白蛋白、dATP、dUTP、dCTP、dGTP，MgCl₂、HotStart Taq酶、逆轉錄酶和UNG酶。

3.根據權利要求2所述的基于微流控芯片的檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的試劑盒，其特征在于，所述引物在擴增體系中的終濃度為100～1000nM；所述探針在擴增體系中的終濃度為50～500nM；所述海藻糖在擴增體系中的終濃度為1％～10％w/v；所述牛血清白蛋白在擴增體系中的終濃度為0.1％～5％w/v；所述HotStart Taq酶、逆轉錄酶、UNG酶在擴增體系中的終濃度為0.5U～5U；所述dATP、dUTP、dCTP、dGTP在擴增體系中的終濃度均為0.1mM～2mM；所述MgCl₂在擴增體系中的終濃度為1.5mM～10mM。

4.根據權利要求1所述的基于微流控芯片的檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的試劑盒，其特征在于，所述陽性質控品中含有肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的擴增基因序列的質粒。

5.根據權利要求1所述的基于微流控芯片的檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的試劑盒，其特征在于，所述主動控制流路的多通量微流控核酸檢測芯片具有微流控流道，包括一條出樣主流道以及若干條分樣流道；各分樣流道分體設置，每個分樣流道對應一個反應腔，能等分各個反應腔的試劑。

6.根據權利要求1-5任一項所述的基于微流控芯片的檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的試劑盒，其特征在于，所述預裝干粉檢測試劑的制備方法為：

(1)將配制好的檢測試劑溶液以單人份分裝到PCR管中，放入-80℃條件下凍存8h以上；

(2)將凍好的檢測試劑放入到真空冷凍干燥機中，設定凍干機程序為：

-50℃，1h，1大氣壓；

-40℃，5h，＜10Pa；

-10℃，2h，＜10Pa；

0℃，2h，＜10Pa；

30℃，5h，＜10Pa；

(3)干燥完成后，取出試劑，即為干粉形態。

7.根據權利要求6所述的基于微流控芯片的檢測肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的試劑盒，其特征在于，所述預裝干粉檢測試劑是預裝在所述主動控制流路的多通量微流控核酸檢測芯片中。

8.一種采用權利要求1-7任一項所述的試劑盒的使用方法，該方法包括以下步驟：

(1)將樣品DNA/RNA共提取模板200μL加入微流控核酸檢測芯片的加樣孔中，蓋好加樣孔蓋，放入微流控芯片檢測儀中檢測；

(2)PCR擴增反應的條件為：

92～97℃預變性1～10min；

92～97℃變性5～10s，58～62℃退火延伸15～30s，30～45個循環；

(3)有效性判定：

陰性對照孔是未加引物探針的空白孔，檢測結果應為陰性，且陽性對照孔檢測出為陽性，否則實驗視為無效；

(4)結果判讀：

根據對應的反應腔的檢測信號給出結果，直接判斷肺炎支原體、肺炎衣原體和嗜肺軍團菌的陰陽性結果。