[發明專利]一種利用蔗糖生物合成D-葡萄糖二酸的方法

有效

• 申請號: 201810178800.0
• 申請日: 2018-03-05
• 公開（公告）號: CN108384796B
• 公開（公告）日: 2021-11-26
• 發明（設計）人: 范立海;曲亞楠;郭強;燕豪杰;譚天偉
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P7/58;C12R1/19
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

一種利用蔗糖生物合成D?葡萄糖二酸的方法旨在提高生物法合成D?葡萄糖二酸的產量。在工程大腸桿菌中嘗試將D?葡萄糖高效轉化為D?葡萄糖二酸的路徑探索耗費了很多年，在混糖發酵中合成D?葡萄糖二酸的產量相比于單糖有所提高。我們在大腸桿菌BL21(DE3)中共表達cscB，cscA，cscK，(蔗糖途徑)Ino1，MIOX，Udh，suhB(D?葡萄糖二酸合成途徑)7個基因，從功能上構建從蔗糖到D?葡糖二酸的途徑，該途徑還未經報導。然后，進一步敲除zwf，pgi，ptsG，uxaC，gudD 5個基因，并且過表達基因Glk，以及構建D?果糖依賴性的翻譯控制系統，用于調控pgi基因的沉默或表達，與此同時使得蔗糖作為唯一碳源，從而獲得更高的產量。

技術領域

本發明屬大腸桿菌代謝工程領域，具體涉及了合成D-葡萄糖二酸的方法，尤其涉及以蔗糖為唯一碳源的，在大腸桿菌中合成D-葡萄糖二酸的方法和路徑。

背景技術

隨著氣候的變化和化石資源的日益減少，人們普遍認為，在未來，生物煉制將替代石油冶煉來生產化學品和化學材料。D-葡萄糖二酸是一種可以進一步轉化為其他增值商品的大宗化學品，包括洗滌劑助劑，腐蝕抑制劑，己二酸，酯和聚酰胺衍生物，因此它被美國能源部(DOE)作為2004年前十二種平臺化學品之一。目前，大部分是用硝酸作為溶劑和氧化劑化學氧化D-葡萄糖來合成D-葡萄糖二酸。但是，化學氧化法存在的很多缺陷，成本過于昂貴并且污染環境。相反，使用微生物發酵來生產D-葡糖二酸，成本更低且更環保

D-葡萄糖二酸天然存在于水果，蔬菜和哺乳動物中，但是依靠大腸桿菌代謝工程和合成生物學能實現從D-葡萄糖微生物發酵來合成D-葡萄糖二酸。通過異源酶共表達得到D-葡萄糖二酸。

然而，當使用D-葡萄糖作為唯一碳源時，D-葡萄糖二酸在大腸桿菌中的產量比較低，因為部分D-葡萄糖被用于產生細胞生物量。先前的報道表明，可使用替代碳源(木糖，阿拉伯糖和甘油)進行細胞生長，同時D-葡萄糖作為碳源生產D-葡萄糖二酸。盡管底物轉化效率優異，但混合糖發酵需要比單獨的D-葡萄糖發酵具備更復雜的工業設計和工藝控制。根據上面表述，我們發現利用蔗糖(葡萄糖和果糖組成的最豐富的天然二糖)作為D-葡萄糖二酸生產的底物和碳源可以完全解決這些問題。與其他糖相比，蔗糖被認為是比D-葡萄糖更具有經濟和環境優勢。而且，細胞中由蔗糖水解的D-葡萄糖和D-果糖可分別用于D-葡糖二酸形成和細胞生長，而不添加額外的碳源。然而，基于蔗糖的大腸桿菌發酵受到挑戰，因為大多數目前的工業大腸桿菌菌株不能利用蔗糖。

發明內容

本發明詣在提高在代謝工程大腸桿菌中D-葡萄糖二酸的產量，并且利用外源調控開關，使得細胞調控自身代謝平衡，在利用D-果糖供給自身生長的同時，讓D-葡萄糖代謝合成D-葡萄糖二酸。

為了實現上述目的，本發明具體技術方案如下：

在代謝工程菌株大腸桿菌BL21(DE3)中利用蔗糖合成D-葡萄糖二酸。首先構建表達所需要的7個基因，然后，將上述所描述基因依次按順序敲除，確保來自蔗糖的大部分的D-葡萄糖用于合成D-葡糖二酸，而D-果糖的水解產物消耗并且支持細胞生長。還優化了D-葡萄糖磷酸化途徑即過表達Glk。更重要的是，為了進一步D-葡萄糖二酸的產量，構建的果糖敏感型開關可以當D-果糖用盡時，利用外源調控開關來平衡糖代謝。

1.一種利用蔗糖生物合成D-葡萄糖二酸的方法，其特征在于：構建了大腸桿菌的蔗糖利用途徑，并且另外過表達了基因Ino1，MIOX，Udh和suhB，提高了大腸桿菌合成D-葡萄糖二酸的產量，并且，在敲除糖酵解和磷酸戊糖途徑的基礎上，敲除ptsG基因來消除ccr效應，添加Glk基因來消除由于敲除ptsG后D-葡萄糖磷酸化的速度的影響，之后又敲除了副產物基因uxaC,gudD基因來進一步提高D-葡萄糖二酸的產量。并且構建了對D-果糖敏感的控制pgi基因沉默或表達的邏輯開關，當D-果糖耗盡時，開關自動打開，使得葡萄糖-6-磷酸進入糖酵解途徑，繼續支持細胞的生長。

2.進一步，所述的利用蔗糖生物合成D-葡萄糖二酸的方法，包括以下步驟：